基于SEM分析的6种松属树种花粉特征及亲缘关系研究

解庆，段君怿，刘志红

(山西农业大学 林学院，山西 太谷 030801)

松属(Pinus)植物是裸子植物中的最大类群，经济价值极高，全球约有80余种。中国产22种10变种，分布广泛。松属植物的分类问题向来广受关注，前人尝试用不同的方法为该属树种的分类提供可靠证据[1～5]。

油松(P.tabulaeformis)的分类地位明确，作为松属代表性物种，常常作为相近树种分类地位研究的参照。但因油松在我国分布很广，形态变异较大，对于油松的种群和名称的界定较混乱，为此，前人经过了不断的实地调查和整理修订。胡先骕、乐天宇将在太行山果松岭海拔2 500 m处的一种树干丛生的油松鉴定为太行松(P.taihangshanensis)。中进猛之进和竹内亮分别将河北雾灵山所产的侧生缩短枝，且其上的叶密生的油松定名为P.tokunagai和P.tabulaeformisvar.tokunagai。刘慎谔、王战的大果油松(P.tabulaeformisf.jeholensis)作为油松的变型，主要特征为：球果较大，可达7 cm；紫翅油松(P.tabulaeformisf.purpurea)与油松的主要表型性状差异为种翅带暗紫褐色。太行松、大果油松、紫翅油松、P.tokunagai和P.tabulaeformisvar.tokunagai等分类单元，或因环境所致，或因性状不稳定，均归并为油松这一物种，经修订，油松种下分类仅保留了2个变种，即黑皮油松(P.tabulaeformisvar.mukdensis)和扫帚油松(P.tabulaeformisvar.umbraculifera)。

黑皮油松、扫帚油松分类地位的界定主要依据经典形态学证据。花粉具有极强的保守性，结构是由物种基因所决定，和植物的营养器官相比更能反映植物的起源、演化、分类、物种及品种鉴定。因此，在前人研究的基础上[6～13]，本文以亲缘关系较近、分类地位明确的松属植物油松及近缘种白皮松(P.bungeana)、樟子松(P.sylvestrisvar.mongholica)和华山松(P.armandi)为参照树种，利用扫描电子显微镜对黑皮油松和扫帚油松等6个树种自然干燥状态下的花粉特征进行观察分析，为黑皮油松和扫帚油松的分类地位的界定提供孢粉学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

白皮松、华山松和樟子松花粉于2017年5～6月采摘自山西省太谷县，油松、黑皮油松和扫帚油松花粉由西北农林科技大学提供。花粉采摘时，选择生长发育健壮无病虫害的成年植株，当各树种进入散粉期前、花粉自然成熟时进行采摘。

每物种选取3株，随机兼顾均匀的采集雄球花，并混合放置于先前准备好的硫酸纸袋中，纸袋用夹子封好后，将纸袋放在温暖、光照条件好的室内环境中，待花粉充分散开后，过100目筛，去除杂质后，将花粉置于密封的试管，再放在干燥设备中，温度保持在2～5 ℃，为后续试验备用。

1.2 方法

参照Nakagawa等[9]和Liu等[10]的方法，将干燥后的6个树种供试花粉，分别均匀涂于粘有双面胶带的样品台上，于JEOL，JFC-1600离子溅射仪中喷金，然后置于JEOL，JSM-6490LV扫描电子显微镜下观察记录。分别选取各树种近极面、远极面、赤道面、体表面纹饰、气囊表面等进行拍照，应用Smile view软件测量花粉的全长、全宽、体长、体宽、气囊长、气囊宽，并据此计算全长/全宽、体宽/全长、气囊长/气囊宽。每树种花粉测量10粒。利用SPSS20.0软件，将上述9项特征指标进行多重比较，并利用平方欧式距离作聚类分析。

2 结果与分析

2.1 花粉粒的大小

由表1中可知，6松属树种花粉大小均值的变动范围为44.00～53.53 μm，樟子松花粉最小，华山松花粉最大，花粉大小排列顺序为华山松>扫帚油松>黑皮油松>白皮松>油松>樟子松。在各树种间，花粉粒体的变异程度较小；气囊宽均小于体宽；气囊长与气囊宽的比值均小于1。在气囊大小的测定中，将气囊长界定为与全长、体长同一轴向上，即气囊长是气囊在远极面观长轴方向的长度，该处理方式与Nakagawa等[9]和Liu等[10]相同，因此气囊长小于气囊宽。

2.2 花粉粒的外部形态

白皮松、樟子松、华山松、油松、黑皮油松和扫帚油松花粉的形态相似，都由体和2个发达而显著的气囊组成，属于双气囊的“松型”花粉(图1)。由近极面观，6个树种花粉轮廓光滑，呈圆形至椭圆形；由赤道面观，气囊和帽交界处较粗糙，易形成帽沿。由远极面观，因供试花粉为自然干燥状态，2气囊收缩至紧贴在一起，萌发沟不可见；气囊表面光滑，且具有穿孔，穿孔有时连接成犁沟状(图1-Ⅰ6)；樟子松气囊表面穿孔最少(图1-Ⅲ6)。

表1 6个松属树种的花粉大小统计Table 1 The statistics of pollen size for 6 pinus taxa

注：平均值±标准差，均值上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note： Mean value±std. deviation. Mean values with different letters are significantly different from each other (P<0.05).

2.3 花粉粒的表面纹饰

虽然不同松属植物间体的特征比较稳定，但在近极面观体的表面纹饰具有较明显的差异。按照表面纹饰的不同，可以分为2类：龟裂状纹饰和团块状突起纹饰。龟裂状纹饰，雕纹堆积起来形成波浪状，表面没有疣状颗粒分布[11]；本研究的6个松属树种的花粉都属于团块状突起纹饰，通过表面疣状颗粒分布的多少又可以将其分成2类：一类表面疣状颗粒有少量分布，雕纹相互堆积形成微波状，包括白皮松、油松、黑皮油松和扫帚油松；另一类表面疣状颗粒分布较多，雕纹平铺，包括华山松和樟子松。

2.4 聚类分析结果

6个树种间平方欧式距离的变幅从10.245到662.637(表2)。黑皮油松、扫帚油松与油松之间的平方欧式距离分别为24.267和11.652。白皮松、华山松、樟子松与油松之间的平方欧式距离分别为24.010、169.429、203.307，平均为132.249；表明黑皮油松与油松、扫帚油松与油松之间的遗传距离远远小于油松与各近缘种之间的遗传距离。黑皮油松、扫帚油松作为油松的种下分类单元是合理的。

由聚类分析树状图可知(图2)，油松与黑皮油松、扫帚油松首先聚为一类，再分别与油松的近缘物种白皮松、樟子松和华山松相聚。表明油松与黑皮油松、扫帚油松亲缘关系最近，这3个树种与白皮松、樟子松亲缘关系较近，与华山松亲缘关系最远。聚类结果亦支持将黑皮油松、扫帚油松作为油松的种下分类这一观点。

3 结论与讨论

在经典植物分类学上，油松、白皮松、华山松为独立物种，分类地位明确；樟子松属于欧洲赤松的变型；黑皮油松、扫帚油松均属于油松的变种。物种的种下分类一般认为有变种、变型和亚种。变种与原变种之间无任何隔离，变异比较稳定；变型与原变种之间也有形态变异，但未形成一定的分布区，表现为零星分布的单株；亚种的分布范围比变种大得多，形态上与原变种有一定区别，在分布上、生态上或季节上有所隔离[14～16]。

本文通过对花粉的大小及表面纹饰的观察分析，黑皮油松、扫帚油松与油松的亲缘关系极为相近，将黑皮油松、扫帚油松界定为油松的种下分类单元。

油松和黑皮油松的生活习性相近，都是喜光植物且能耐干旱瘠薄；在形态方面，也极为相似，生长最高高度均达25 m，胸径也都能达到1 m以上；分布区无隔离。扫帚油松与油松的主要区别表现茎干基部多分枝，但扫帚油松并没有形成一定的分布区，呈单株零星分布。因此认定黑皮油松为油松的变种，扫帚油松为油松的变型，扫帚油松的拉丁名建议为P.tabulaeformisf.umbraculifera。

油松与白皮松、樟子松、华山松同为松属植物。松属包括两个亚属：单维管束松亚属和双维管束松亚属。白皮松属于单维管束松亚属；油松、樟子松和华山松属于双维管束松亚属，油松和樟子松的针叶为2针一束，华山松的针叶为5针一束，油松与樟子松的亲缘关系比油松与华山松的亲缘关系近。

图1 6种松属树种花粉形态的扫描电镜观察Fig.1 SEM pictures of pollens of 6 Pinus species 注：(I1-I6为白皮松，II1-II6为华山松，Ⅲ1-Ⅲ6为樟子松，IV1-IV6为油松，V1-V6为黑皮油松，VI1-VI6为扫帚油松，I1-VI1为远极面观，I2-VI2为近极面观，I3-VI3为赤道面观，I4-VI4为近极面体的表面纹饰×5000，I5-VI5为近极面体的表面纹饰×10000，I6-VI6为气囊表面特征×5000)。 Note:(I1-I6 P. bungeana,Ⅱ1-II6 P. armandi, Ⅲ1-Ⅲ6 P. sylvestris var. mongholica, IV1-IV6 P. tabulaeformis, V1-V6 P. tabulaeformis var. mukdensis, VI1-VI6 P. tabulaeformis var. umbraculifera, I1-VI1 Distal view, I2-VI2 Proximal view, I3-VI3 Equatorial view, I4-VI4 Corpus exine ornamentation×5000, I5-VI5 Corpus exine ornamentation×10000, I6-VI6 Saccus surface×5000).

树种Taxa平方欧式距离Squared Euclidean distance白皮松P. bungeana华山松P. armandi樟子松P. sylvestris var.mongholica油松P. tabulaeformis黑皮油松P. tabulaeformis var. mukdensis扫帚油松P. tabulaeformis var. umbraculifera白皮松0.000156.483176.48224.01032.91923.216华山松156.4830.000662.637169.429278.590198.016樟子松176.482662.6370.000203.307105.530171.142油松24.010169.429203.3070.00024.26711.651黑皮油松32.919278.590105.53024.2670.00010.245扫帚油松23.216198.016171.14211.65210.2450.000

图2 6种松属植物的聚类分析Fig.2 Dendrogram of 6 Pinus taxa based on pollen characteristics 注：(BPS为白皮松，HSS为华山松，ZZS为樟子松，YS为油松，HPYS为黑皮油松，SZYS为扫帚油松)。 Note:(BPS, P. bungeana; HSS, P. armandi; ZZS, P. sylvestris var. mongholica; YS, P. tabulaeformis; HPYS, P. tabulaeformis var. mukdensis; SZYS, P. tabulaeformis var. umbraculifera).

按该分类法，油松与樟子松的亲缘关系应该比油松与白皮松近，但在本试验聚类图(图2)中所示，油松与白皮松的亲缘关系却比油松与樟子松的亲缘关系近，原因可能是：单、双维管束松亚属的划分主要以针叶中维管束的数量为依据，隶属解剖学特征。目前，植物分类常用的方法包括形态学分类法、解剖学分类法、细胞学分类法、孢粉学分类法、化学分类法和DNA分子标记分类法，每一种方法都有不可替代的优越性和不可避免的局限性。植物的分类须结合多种方法、综合分析，才能更准确地反映植物间的亲缘关系和分类地位。从本文提供的孢粉学证据来看，相比樟子松，白皮松的花粉性状特征与油松更加接近，这与谢树莲和凌元洁[13]的结果一致。油松、白皮松与樟子松之间的亲缘关系有待进一步研究。