miRNA在绝经后骨质疏松症肾阴虚证中的表达谱特征及生物信息学分析

谢丽华 陈娟 谢冰颖 许惠娟 陈赛楠 叶云金 葛继荣

福建省中医药研究院骨质疏松证候基因组学重点研究室，福建 福州 350003

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是常见的老年性疾病，发病率高。中医药能显著改善骨质疏松症症状、防治并发症、提高生存质量和延长寿命等。但是中医药强调其基本理论及原理的阐述，对现代疾病生物学本质的探索不足，如能在生物学层面运用现代生物学技术对中医证候的实质进行深入的阐述，这将更有利于中西医的沟通与结合。表观遗传学是当前研究的一个热点，它能很好地阐述“遗传-环境-疾病”相互作用机制和关系，而这种“环境疾病”模式与传统中医理论中“天人合一”的整体观相符。所以将表观遗传学的概念及相关技术引入到中医基础理论的研究会有所突破，并有新发现的可能。

miRNA作为表观遗传学主要研究的内容之一，主要作用环节在基因转录后进行调控。miRNA是一类存在于真核生物体内，长22～25 bp的内源性非编码单链RNA分子，通过与靶基因的特异性碱基配对引起靶序列降解或翻译阻遏，从而对靶基因的表达进行转录后水平的调控[1-3]。研究表明miRNA参与生命过程中一系列的重要进程，包括细胞增殖、分化、凋亡、发育等多种生物学过程[4]。课题组前期已经多次应用全基因组表达谱芯片技术开展证候-基因组研究，发现肾阴虚证主要集中于代谢、免疫功能类基因的表达异常[5-7]。在此系列研究的基础上，本实验选择为基因调控环节的miRNA，计划在沿用病症结合的研究思路基础上，采用miRNA芯片，观察PMOP肾阴虚证的miRNA表达变化情况，旨在为阐明PMOP肾阴虚证的本质及为治疗提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象

采用病例对照研究方法，选择绝经后2年以上、75岁以下的受试者，对受试者进行问卷调查，检测肝肾功能、血尿常规、心电图和B超等。双能X线骨密度仪检测正位腰椎L1～4和左侧股骨上端骨密度，中医辨证，分组如下：PMOP肾阴虚组3例，PMOP肾阳虚组3例，健康绝经后妇女3名作为对照组。本研究方案获得福建省中医药研究院中医药临床研究伦理委员会审批通过。(1)诊断标准：骨质疏松症诊断参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准》(第2稿)[8]，中医证候诊断标准参照《中医虚证辨证参考标准》[9]。(2)纳入标准：符合骨质疏松症诊断标准；符合中医辨证标准；年龄在46～75岁，自然绝经2年以上的汉族妇女；受试者知情同意。(3)排除标准：不符合骨质疏松症诊断及中医肾阴虚证辨证标准者；类风湿性关节炎、糖尿病、甲状腺功能亢进等继发性骨质疏松症者；合并有心脑血管严重疾病者；肝、肾功能检查异常者；最近一个月用过中药治疗骨质疏松症者，或近3个月内用激素替代治疗、使用降钙素者，或近6个月内有连续15 d用双膦酸盐等防治骨质疏松症者。

1.2 用miRNA芯片技术检测miRNA表达谱及筛选差异表达基因

1.2.1样品RNA提取和质检：取外周血5 mL，淋巴细胞分离液提取静脉血中的单个核细胞，使用Trizol法提取细胞的总RNA，Nanodrop测定RNA 260/280的吸光度及浓度，用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。

1.2.2芯片杂交及扫描：基因芯片使用Agilent miRNA芯片，委托北京博奥生物技术有限公司进行。对Total RNA进行纯化，纯化后重新定量。Total RNA 的去磷酸化、标记、杂交，在洗液中清洗甩干后，使用 Agilent 芯片扫描仪对芯片进行扫描，得到杂交图片。

1.2.3图像采集和数据分析：使用Agilent Feature Extraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据，然后使用Agilent Gene Spring软件对数据进行归一化和差异分析。基于数据库KEGG查询差异涉及miRNA的信号通路，及相关靶基因数据库分析序列以及预测靶基因。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计，计量资料用均数±标准差表示，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者数量分析

纳入对象9人均进入结果分析，无中途退出者。

2.2 PMOP肾阴虚证组与其他2组miRNA表达谱的差异性分析

PMOP肾阴虚证组与对照组相比，筛选差异表达miRNA49条；PMOP肾阴虚证组与PMOP肾阳虚证组相比，筛选差异表达miRNA71条；PMOP肾阴虚证组分别与其他2组比较，有20条共同的差异表达miRNA，与正常对照组相比，其中表达上调的miRNA有17条，表达下调的miRNA有3条(见表1)。

表1 PMOP肾阴虚证组与其他2组比较共同差异表达miRNATable 1 Differential expression of miRNA in Kidney Yin deficiency group compared with the other two groups

2.3 实时荧光定量PCR验证芯片结果

根据miRNA表达谱芯片检测的结果，随机选取3个表达变化显著的miRNA (hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p)用实时荧光定量PCR再次验证，内参选择snRNAU6。结果显示(图1)，与对照组相比，PMOP肾阴虚组hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p表达水平明显升高(FC=3.56、4.20)，hsa-miR-95-3p表达明显下调(FC=2.10)，3条miRNA在芯片样本中得到较好的验证，qPCR的结果与芯片数据趋势一致。

图1 定量PCR验证基因芯片的结果Fig.1 Confirmation of microarray results using quantitative PCR

2.4 差异表达miRNA的pathway分析

将差异表达的miRNA用KEGG数据库进行pathway分析，选取前30个显著富集的kegg通路，根据P值绘制成柱状图(图2)，主要包括代谢通路、癌症通路、Rap1信号通路、粘着斑信号通路、PI3K-Akt、MAPK信号通路、钙离子信号通路、内质网蛋白加工、cGMP-PKG信号通路、Ras信号通路、Wnt信号通路。

2.5 差异表达miRNA的靶基因预测

为了更全面地了解PMOP肾阴虚证相关miRNA的功能，同时采用miRWalk、Microt4、miRanda、miRdb、miRMap、PicTar2、PITA、RNA22、Targetscan、RNAhybrid 10个数据库逐一预测这20个miRNA的靶基因，进行综合统计分析，最终结果取6个数据库预测结果的重叠部分，为了进一步缩小靶基因预测范围，从结果中挑选出同时被5个miRNA同时作用的靶基因，共9个(见表2)。

3 讨论

随着对miRNA功能研究的深入，越来越多的研究发现miRNA与人类疾病的发生发展过程密切相关。miRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用。许多miRNA被证明在骨代谢中都起到了关键的调控作用，参与维持骨代谢的平衡。例如miR-133 a和miR-204通过抑制成骨分化中关键的转录因子Runx2，抑制成骨细胞分化[10-11]；有些miRNA在骨重建过程中有双重作用，如miR-214既能促进破骨细胞形成，同时也能抑制骨形成[12-13]。对这些miRNA的深入研究可以为骨代谢的疾病诊断与治疗提供新的思路与方法。本研究以miRNA芯片技术为研究手段，通过探讨PMOP肾阴虚证组与PMOP肾阳虚证组和健康绝经后妇女3组miRNA基因差异的表达情况，揭示与PMOP肾阴虚证相关的miRNA表达谱特征，旨在整体miRNA表达水平阐明POP肾阴虚证的本质。研究结果发现肾阴虚证组与对照组、肾阳虚证组的差异表达miRNA分别为49条、71条；肾阴虚证组与其他两组比较，筛选出20条共同差异表达miRNA，和对照组相比，其中表达上调的有17条，表达下调的有3条。随后挑选hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p这3条miRNAs进行qPCR验证，证实qPCR的表达数据与芯片数据趋势一致。

图2 显著富集的kegg信号通路Fig.2 Significantly enriched kegg pathway

表2 差异表达miRNA的靶基因预测Table 2 Target gene prediction results of differential expression of miRNA

miRNA是机体中一个庞大复杂的调控网络体系，对miRNA相关信号通路的研究是了解其调控机理的重要方式。笔者对这些差异miRNA进行根据pathway分析，发现这些miRNA主要参与代谢通路、癌症通路、Rap1信号通路、粘着斑信号通路、PI3K-Akt、MAPK信号通路、钙离子信号通路、内质网蛋白加工、cGMP-PKG信号通路、Ras 信号通路、Wnt信号通路的调控等。研究证实，这些信号通路的多条通路都参与了骨代谢的调控。PI3K-Akt信号通路广泛存在于细胞中，能调控成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化及凋亡[14-15]，Akt及其下游的靶基因是骨形成的关键调控者。Wu等[16]研究证实四物汤的提取物可以通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路促进骨形成进而防止骨质疏松。MAPK 信号通路主要包括 ERK1/2通路、JNK 通路、P38 通路和 ERK5通路。Kim等[17]的研究结果表明胶原蛋白水解物可以通过ERK/MAPK通路促进成骨细胞分化和增殖； Hah等[18]实验说明JNK 通路在成骨细胞分化和生存中具有重要作用；Choi等[19]和Rodríguez-Carballo等[20]报道了P38通路可以通过促进骨形成和抑制破骨细胞分化改善骨质疏松。Wnt信号通路对成骨细胞的分化和骨形成具有重要的促进作用，它可以通过调节Runx2等成骨标志性基因的表达，促进成骨细胞分化[21]。此过程对于骨形成非常重要，当该通路紊乱时会导致骨质疏松。由于Wnt信号通路在成骨细胞中扮演着重要角色，已成为药物设计的靶标，并被成功地应用于临床。如Romosozumab药物已经完成临床II期研究阶段，目前正在进行III期临床项目。Romosozumab是一种全人源化单克隆抗体，通过抑制骨硬化蛋白活性，激活Wnt通路而促进骨形成，从而促进成骨作用[22-23]。总之，骨质疏松发病机制复杂，多种相关信号通路之间存在交互和交叉的作用，具体机制还需进一步深入研究。

miRNA功能研究的重点在于对其靶基因调控的研究。miRNA通过精确地调控靶基因表达进而参与细胞的生长、发育、分化、凋亡等生物学过程。通过实验结合生物信息学的方法，2009年Friedman等[24]预测，miRNA作用的靶基因数量超过45 000个，调控了人类2/3以上的蛋白质编码基因。一个miRNA可以有不同的靶基因，一个靶基因也可以由多个miRNA调控。通常认为，受多个miRNA同时作用靶基因更有可能发挥重要作用[25]。笔者最终筛选出9个miRNA的靶基因(RC3H1、SOX11、FUT4、GABRA4、NUFIP2、ONECUT2、PHF20、PURB、ZNF148)，其中SOX11、PHF20基因被认为与骨的生长、发育相关。SOX11基因在许多干细胞中都有表达，包括骨祖细胞，在细胞的发育过程中，SOX11基因对于细胞的存活和分化起了重要作用，并能通过诱导生长板的形成促进骨骼生长[26]。SOX11基因过表达可以显著促进老鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化[27]，机制可能是通过促进成骨细胞重要的转录因子Runx2和OSX的表达，进而促进成骨分化[28]。大鼠全身性敲低PHF20基因会表现出腰椎发育异常[29]，研究其发病的具体机制，Yang等[30]通过过表达PHF20基因，发现它可以增加ALP活性和骨矿化形成，及骨形成标志物Runx2的表达，进而促进成骨细胞分化。相反，抑制PHF20表达会降低骨形成及骨矿化作用。

综上所述，本实验采用miRNA芯片技术研究PMOP肾阴虚证中差异表达miRNA，并对这些miRNA进行pathway分析及靶基因预测。结果表明，这些差异表达miRNA可能通过调控PI3K-Akt、MAPK、Wnt信号通路等与骨代谢相关信号通路参与PMOP肾阴虚证的发生发展过程。这只是对PMOP肾阴虚证miRNA基因表达谱的初步探讨，今后需要扩大样本验证miRNA，及进一步探讨miRNA与靶基因的关系，并对miRNA进行体内实验功能验证。通过对差异miRNA及其调控的靶基因深入研究，将有助于理解PMOP肾阴虚证的本质及为治疗提供新的思路与方法。