长春市汉族女性维生素D受体基因BsmⅠ和FokⅠ位点多态性与骨密度相关性研究

马倩倩 毛未贤 高远 宋世凯 尹纪伟 张萌萌

吉林省骨质疏松诊疗中心(吉林大学第四医院)，长春 130011

维生素D是维持正常骨代谢的重要调节因子，维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)是介导1,25-(OH)2D3发挥生物效应的核内生物大分子，属于类固醇/甲状腺激素受体超家族成员[1]。自1994年Morrison等[2]首次揭示VDR基因多态性与骨密度(bone mineral density，BMD)有关联以来，VDR基因已成为国内外研究最广泛的与骨代谢相关的基因之一。VDR基因多态性分别对应多个酶切位点，其中研究较深入的有BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ4个位点，但是不同种族、不同地区研究结果不尽相同[3]。本文研究长春市230例35～85岁汉族女性BsmⅠ、FokⅠ位点多态性及其BMD的相关关系。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取我院体检和住院的长春市230例35～85岁汉族女性，平均年龄(58.5±12.2)岁。在长春市长期居住10年以上且相互无血缘关系，排除急、慢性肝、肾疾病、糖尿病、高血压、甲状旁腺机能亢进、甲状旁腺机能减退、甲亢、甲减、肿瘤及放化疗患者。记录受试者一般情况，按照绝经情况分为绝经组142例[(64.9±8.1)岁]和未绝经组88例[(45.3±5.8)岁]。

1.2 实验仪器

德国Eppendorf Mastercycler pro梯度PCR仪，美国伯乐Biorad 164-5052电泳仪，美国SYNGENE凝胶成像系统，Hologic Discovery WA型骨密度仪。

1.3 方法

1.3.1提取基因组DNA：抽取230例受试者外周静脉血3 mL，采用磁珠法DNA提取试剂盒(长春志昂生物科技)，严格参照试剂盒说明进行操作。

1.3.2引物设计与合成：BsmⅠ位点：上游引物5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′，下游引物5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′；FokⅠ位点：上游引物5′-AGCTGGCCCTGGCACTGAC TCTGCTCT-3′，下游引物5′-ATGGAAACACCTT GCTTCTTCTCCCTC-3′(吉林省库美生物合成)。

1.3.3PCR：提取的DNA模板4.5 μL，10 μM上下游引物各1.5 μL，2×Taq PCR Mix 15 μL(康润生物)，去离子水7.5 μL补至30 μL反应体系。94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环。

1.3.4限制性内切酶酶切分析：取PCR产物10 μL，加入BsmⅠ/FokⅠ快速内切酶(美国Thermo Fisher)1 μL，10×FastDigest Buffer 2 μL，去离子水17 μL补至30 μL反应体系，37 ℃水浴5 min进行酶切，65 ℃水浴5 min终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，紫外凝胶成像系统下观察条带，650 bp和175 bp两条带为bb型，825 bp一条带为BB型，825 bp、650 bp和175 bp 3条带为Bb型；265 bp一条带为FF型，196 bp和69 bp两条带为ff型，265 bp、196 bp和69 bp 3条带为Ff型。

1.3.5采用Hologic Discovery WA型骨密度仪检测腰椎正位(L1～4)BMD，每次开机后均用模体校正，测量误差小于0.5%。

1.4 统计学分析

应用SPSS 19.0软件进行统计分析，基因型频率分布采用χ2检验，各基因型BMD分析采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在本研究人群中，BsmⅠ位点基因型以bb型为主，占83.9%，BB型只发现8例，占3.5%，Bb型占12.6%，b等位基因频率高达90.2%，B等位基因频率为9.8%；FokⅠ位点基因型ff、Ff和 FF分别占18.3%、43.9%和37.8%，f等位基因频率为40.2%，F频率为59.8%，两位点基因分布均符合Hardy-Weinberg定律(χ2=1.283，P=0.125；χ2=0.96，P=0.342)；未绝经组与绝经组各基因型分布组间差异无统计学意义(P>0.05)；BsmⅠ位点在未绝经组和绝经组中各基因型BMD差异无统计学意义(P>0.05)；FokⅠ位点ff型BMD较FF型和Ff型低，但在未绝经组中差异无统计学意义(P>0.05)，绝经组中ff型与FF型比较，BMD差异有统计学意义(P<0.05)。

230例受试者BsmⅠ和FokⅠ酶切位点基因型及等位基因频率分布见表1，未绝经组与绝经组BsmⅠ、FokⅠ位点基因型分布见表2、3，BsmⅠ和FokⅠ两个位点各基因型腰椎(L1～4)骨密度值见表4。

表1 BsmⅠ和FokⅠ位点基因型及等位基因频率分布Table 1 BsmⅠand FokⅠgenotype and allele frequency distribution

表2 未绝经组与绝经组BsmⅠ位点基因型分布Table 2 BsmⅠgenotype distribution in premenopausal group and postmenopausal group

表3 未绝经组与绝经组FokⅠ位点基因型分布Table 3 FokⅠgenotype distribution in premenopausal group and postmenopausal group

3 讨论

骨质疏松症是遗传和环境因素共同参与的多因子复杂疾病，VDR基因是目前研究最广泛的与骨代谢相关的基因之一[4]。VDR等位基因多态性与骨密度、骨转换、肠道钙吸收存在一定关联，能特异地结合1，25(OH)2D3并作用于靶细胞核，发挥调节成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞分化、增生的生物学作用，从而影响骨钙化、骨骺生长[5]。受性别、年龄、民族、受试人种、样本量、环境影响等多种因素影响，目前VDR基因BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ等位点多态性与骨质疏松的研究结论没有一致的结果[3]。

在BsmI酶切位点，Saadi等[6]报道了我国人群B等位基因频率不到10%。王秀玲等[7]研究显示，哈尔滨地区部分汉族人群b等位基因出现的频率为91.8%，B等位基因出现的频率为8.2%，BB型占0%，Bb型占16.3%，bb型占83.7%。在本研究人群中，BsmⅠ位点基因型以bb型为主，占83.9%，BB型占3.5%，Bb型占12.6%，b等位基因频率高达90.2%，B等位基因频率为9.8%，与Saadi等[6]、王秀玲等[7]的研究结果基本一致。与Zhang等[8]对中国汉族绝经妇女研究结果接近(bb、Bb、BB基因型分布分别为90.5%、9.5%、0%)，与朝鲜族绝经期妇女的研究结果不一致(bb、Bb、BB基因型分布分别为38.1%、55.56%和6.35%)。与韩国人相似(11%左右)，略低于日本人(15%～20%)[9]。而与美国及其他西方国家的研究结果不同，美国、澳大利亚以Bb基因型最多[10]。提示种族不同，导致VDR基因多态性的差异。

表4 BsmⅠ和FokⅠ两个位点各基因型腰椎(L1～4)骨密度值比较(g/cm2)Table 4 Spine lumbar (L1-4) BMD value of each genotype of BsmⅠand FokⅠ(g/cm2)

注：*表示ff基因型骨密度值与FF型比较差异有统计学意义(P<0.05)，其他各基因型骨密度差异无统计学意义(P>0.05)。

本研究结果显示BsmⅠ位点各基因型BMD差异无统计学意义(P>0.05)。与缪应新等[11]对611名上海地区汉族人VDR基因型与BMD关系的研究结果一致，认为VDR基因型和BMD无关联。吴文等[12-13]对广州地区绝经后妇女VDR基因多态性与BMD关系的研究结果显示，bb与Bb、BB基因型在腰椎BMD差异有统计学意义(P<0.05)，而对绝经前妇女的研究结果显示各基因型与BMD无关。

FokI多态性位点位于VDR基因第2外显子的起始区，是目前所了解的VDR基因多态性中惟一个改变氨基酸序列长度的位点。VDR基因中FokI位点基因型以Ff为主[5]。在本研究结果中，Ff型占 43.9%，ff和FF分别占18.3%、37.8%。与韩昕等[14]对北京地区230名健康汉族男性FokⅠ多态性研究结果基本一致(FF占36.96%，Ff占46.96%，ff占16.08%)。与Morita等[15]所报道的日本女性结果接近(FF占38.7%，Ff占47.7%，ff占13.6%)。

本研究显示，FokⅠ位点ff型BMD较FF型和Ff型低，但在未绝经组中差异无统计学意义(P>0.05)，绝经组中ff型与FF型比较差异有统计学意义(P<0.05)。与韩昕等[14]对北京地区汉族男性FokⅠ多态性位点与BMD关系的研究结果相似，该研究显示40～59岁年龄段男性ff基因型腰椎L2～4BMD较FF型低(P=0.001)。Yasovanthi等[16]研究也显示FokⅠ基因多态性与低骨量有关。Kalak等[17]在波兰西部地区的研究发现该地区人群腰椎BMD ff(0.792 g/cm2)

综上所述，本研究显示VDR基因多态性与性别、年龄、民族、样本量、环境影响等多种因素相关，目前对女性VDR基因多态性与BMD的研究较多，但儿童和男性的研究较少，因此仍需开展更多高质量大样本的研究进一步验证。本研究工作仍在进行中，以后将进一步增加男性受试者和总的样本量，以期更好地评价VDR基因多态性对骨质疏松的影响。