Tu-1菌剂替代抗生素对獭兔肠道消化酶活力、盲肠菌群及生长性能的影响

苏 可，刘艳玲，姜军坡*，王世英*，梁亚男

(1.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001； 2.保定市徐水区农业局，河北 保定 072550)

在獭兔集约化、规模化的养殖中，由大肠杆菌等病原菌引起的传染性腹泻常发生于仔幼兔群，其具有传染速度快、死亡率高、难治愈的特点，严重阻碍了仔幼兔的生长发育[1-2]。为了避免仔幼兔腹泻导致的大量死亡及经济损失，养殖户一般采用在饲料中加入抗生素的方法来防治，但长期使用抗生素会造成耐药菌产生[3-4]、肠道微生态破坏[5]及畜产品药物残留[6]等，直接或间接危害着人类的健康。微生态制剂作为合适的抗生素替代品具有无毒、无污染、无副作用、无残留的特性，且成本较低，防治效果好[7-9]。Tu-1菌株是以大肠杆菌的拮抗活性为主要筛选指标，从健康兔盲肠中分离得到的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[10]。本试验将Tu-1菌剂和预防剂量的硫酸黏杆菌素分别添加至断奶獭兔饲料中，研究它们对獭兔肠道酶活力、盲肠菌群、生长性能及腹泻的影响，为Tu-1菌剂替代抗生素饲料添加剂在养兔业中的应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 菌剂

Tu-1微生物饲料添加剂由河北农业大学研制、河北众邦生物技术有限责任公司生产。其以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Tu-1菌株发酵制备，活菌(芽孢)含量1.0×1010cfu/g，以下简称Tu-1菌剂。

1.2 培养基

PCA培养基：按照GB/T 4789.2—2010配制，用于分离、计数细菌。EMB培养基：按照GB 4789.38—2012配制，用于鉴别、计数大肠杆菌。MRS培养基：按照GB/T4789.35—2010配制，用于鉴别、计数乳酸杆菌。BBL琼脂培养基：按照GB/T4789.34—2012配制，用于分离、鉴别、计数双歧杆菌。

1.3 试验设计及饲养管理

根据生长状况相似、公母各半的原则，选取60只40日龄健康断奶獭兔，随机分为对照组、抗生素组和菌剂组，每组5个重复，每个重复4只(公母各半)，分养于獭兔养殖笼内。对照组饲喂基础全价颗粒饲料；抗生素组饲喂添加20 mg/kg硫酸黏杆菌素制成的含抗生素的基础全价颗粒饲料；菌剂组饲喂添加1.0‰Tu-1菌剂制成的含微生物饲料添加剂的基础全价颗粒饲料。基础全价饲料组成及营养水平见表1。预试期5 d，正试期30 d。于正试期开始前和结束后对每只獭兔空腹称始、末体质量，并结算各组剩余饲料。每天观察记录獭兔腹泻情况，计算各组獭兔腹泻率。腹泻率=∑(腹泻兔数×兔腹泻天数)/(试验兔数×试验天数)×100%。

兔舍自然通风，每天早、晚定时定量喂料2次，每次投喂量约50 g/只，试兔自由采食和饮水。每天打扫兔舍，保持干净卫生的饲养环境，并按照獭兔饲养要求统一免疫和驱虫。饲养试验在河北省保定市大庄獭兔养殖场进行。

表1 基础全价颗粒饲料组成及营养水平

1.4 样品采集

试验期结束后，每组随机选取10只獭兔屠宰，解剖分离得十二指肠、空肠、回肠、盲肠内容物，现场测定盲肠内容物10倍稀释液的pH值[11]。其余立即放入灭菌后的离心管中，置于液氮中冷冻，带回河北农业大学实验室放入-20 ℃冰箱中备测。

1.5 各肠段消化酶活力测定

待测样品的制备：称取肠段内容物各0.5 g，加2.0 mL蒸馏水，8 000 r/min离心取上清液，即为5倍稀释的待测酶液。

采用GB/T 28715—2012、GB/T 2440—2009、NY/T 912—2004和GB/T 23535—2009所示的方法分别测定待测酶液的酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶活力。

1.6 盲肠菌群数量测定

取盲肠内容物，用灭菌生理盐水进行10倍系列稀释至10-7。选择3个适当稀释度溶液各0.1 mL分别涂布PCA、EMB、MRS和BBL琼脂培养基平板，每种平板每个稀释度涂布3个。PCA和EMB平板在36 ℃培养48 h，MRS和BBL琼脂培养基平板需在36 ℃厌氧培养48 h。选择30～300 cfu/皿的平板进行计数，结果以lg (cfu/g)表示。

1.7 数据处理

试验数据采用Excel软件整理，SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，LSD法进行组间差异显著性检验。数据以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 Tu-1菌剂对獭兔肠道消化酶活力及pH值的影响

由表2可知，菌剂组的十二指肠、空肠、回肠和盲肠蛋白酶活力比对照组分别提高13.05%、17.95%、21.27%和31.58%(P<0.05)，菌剂组的十二指肠、空肠、回肠和盲肠淀粉酶活力比对照组分别提高13.93%、14.23%、45.51%和49.58%(P<0.05)，菌剂组的十二指肠、空肠、回肠和盲肠脂肪酶活力比对照组分别提高11.71%、18.17%、19.22%和26.84%(P<0.05)，菌剂组的十二指肠、空肠、回肠和盲肠纤维素酶活力比对照组分别提高69.84%、83.43%、111.06%和54.59%(P<0.01)；抗生素组的十二指肠、空肠、回肠和盲肠纤维素酶活力比对照组降低了16.67%、28.57%、12.90%和23.41%(P<0.05)，其他3种酶活力与对照组基本一致。

菌剂组盲肠的pH值比对照组降低0.72(P<0.05)，其他各肠段的pH值也略低于对照组(P>0.05)；抗生素组各肠段pH值与对照组相比无显著变化。

2.2 Tu-1菌剂对獭兔盲肠菌群的影响

由表3的数据可知，菌剂组盲肠中大肠杆菌的数量比对照组极显著降低(P<0.01)，而乳酸杆菌和双歧杆菌的数量均比对照组显著提高(P<0.05)，细菌总数变化不显著；抗生素组盲肠中大肠杆菌和细菌总数均极显著低于对照组(P<0.01)，而乳酸杆菌和双歧杆菌数量比对照组略低(P>0.05)。

表2 Tu-1菌剂对獭兔肠道消化酶活力及pH值的影响

注：同列相同肠段不同小写字母上标表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母上标表示差异极显著(P<0.01)，下同。

表3 Tu-1菌剂对獭兔盲肠菌群数量的影响

2.3 Tu-1菌剂对獭兔生长性能及腹泻率的影响

表4的结果表明，菌剂组和抗生素组的日增体质量比对照组分别提高16.61%和13.74%(P<0.05)；菌剂组的料重比、腹泻率与对照组相比分别降低了9.51%、68.11%(P<0.05)，抗生素组的料重比、腹泻率比对照组分别降低了8.29%、64.03%(P<0.05)，且菌剂组和抗生素组之间无显著差异。

表4 Tu-1菌剂对獭兔生长性能及腹泻率的影响

3 结论与讨论

本试验结果表明，Tu-1菌剂能够显著提高獭兔肠道消化酶活力，抑制盲肠大肠杆菌，促进乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌的生长；硫酸黏杆菌素对肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力没有影响，显著降低獭兔肠道纤维素酶活力，硫酸黏杆菌素显著降低盲肠中大肠杆菌数量和细菌总数，对乳酸杆菌、双歧杆菌无明显抑制作用。Tu-1菌剂在提高獭兔日增体质量，降低料重比和腹泻率方面优于硫酸黏杆菌素，但二者无显著差异。因此，Tu-1菌剂在提高獭兔生产性能和肠道消化酶活力，维护肠道微生态平衡和降低腹泻率方面优于硫酸黏杆菌素。

本试验结果表明，Tu-1菌剂和硫酸黏杆菌素均能显著提高獭兔生长性能并显著降低腹泻率，但二者对肠道消化酶和盲肠菌群的影响有明显不同，这提示二者的作用机制可能不同。Tu-1菌剂进入獭兔肠道后，经自身生长繁殖产生或促进肠道产生蛋白酶、淀粉酶等各种消化酶，提高饲料各种主要营养物质的消化吸收，并通过竞争附着位点、生物夺氧、营养竞争、产生抑菌物质等方式抑制病原菌生长，调节维护肠道微生态[12-13]；而硫酸黏杆菌素则是通过改变肠壁组织结构状态促进营养物质吸收，杀灭包括病原菌在内的部分肠道微生物，降低微生物对宿主营养物质的竞争起到促生长的作用[14]。

顾雅君等[15]在Tu-1菌株的基础上进一步分离筛选得到Tu-2菌株，制备了Tu-2制剂，并将Tu-2制剂添加至饲料中，研究其对肉兔粪便消化酶活性和生长性能的影响，结果表明，添加该制剂后肉兔粪便中纤维素酶、蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶的平均活力比对照组分别提高36.65%、31.81%、20.99%和23.08%，平均增体质量提高16.40%，料重比降低l4.15%。这与本试验中Tu-1菌剂显著提高獭兔各肠段消化酶的活力，显著提高獭兔生长性能的试验结果相一致。本试验中，Tu-1菌剂可显著降低獭兔盲肠中大肠杆菌的数量，主要是因为Tu-1菌株是利用大肠杆菌的拮抗性为主要筛选指标从健康獭兔盲肠中分离得到的芽孢杆菌[10]，而乳酸杆菌和双歧杆菌的数量比对照组均显著提高，可能是由于Tu-1菌剂进入肠道后，利用肠道内环境进行生长繁殖，消耗肠道内过多氧气，制造厌氧环境，促进厌氧菌生长的缘故[16-17]。硫酸黏杆菌素使盲肠中大肠杆菌和细菌总数极显著低于对照组，而对乳酸杆菌和双歧杆菌数量基本无影响，其原因是硫酸黏杆菌素主要杀灭肠道中敏感的革兰氏阴性菌[18-19]，对乳酸杆菌和双歧杆菌等革兰氏阳性菌几乎无作用。

本试验测得对照组獭兔(75日龄)各肠段的pH值变化规律为回肠>空肠>十二指肠>盲肠，这与高振华等[20]研究獭兔消化道pH值的变化规律得到的结果一致。与对照组相比，Tu-1菌剂能够显著降低盲肠内容物的pH值，这可能是因为该菌株在盲肠中产生了较多纤维素酶，分解纤维素产生葡萄糖等小分子糖类后又被微生物利用产生较多的有机酸所致。但在肠道的前段菌株尚未充分生长繁殖，影响较小，因此十二指肠、空肠、回肠的pH值只是稍有下降，未达到显著水平。