肺癌患者血清特异性核酸适配体的筛选及鉴定

邸 娅，赵运旺，卢坤玲，何 雷，徐 欢，郑 岳

1秦皇岛市第一医院，河北 秦皇岛 066000；2燕山大学环境与化学工程学院，河北 秦皇岛 066004

肺癌患者的5年生存率极低，仅有5%～10%[1]。早期诊断和早期治疗是提高肺癌生存率的关键。目前，临床上采用肺癌血清肿瘤标志物联合检测的诊断手段，提高了肺癌诊断的准确性和灵敏度[2]。最常见的肺癌血清肿瘤标志物有：神经元特异性烯醇化酶（NSE）、癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）、胃泌素释放肽前体（ProGRP）、鳞状细胞癌相关抗原（SCC-Ag）等[3]。血清中蕴藏着丰富的与疾病早期诊断相关的组织学信息，血清中包含有白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、脂蛋白等高丰度蛋白。小分子量蛋白质组学研究的对象包含有几类重要生理学功能的蛋白，像细胞因子类、炎症趋化因子类、多肽类激素，另外还有大分子量蛋白的酶切片段和大量的肿瘤标志物，它们与疾病的发生发展关系密切[4-6]。

核酸适配体（Aptamer）是一种具有高亲和力、强特异性的识别目标靶分子的ssDNA或RNA[7]，其作用的靶标分子范围比较广泛，无免疫原性，稳定性好且易于修饰等，因而可以代替抗体用于临床检测和治疗。Aptamer的筛选主要依赖于SELEX技术，SELEX技术自创立以来发展迅速，已在生物学和基础医学研究、临床检测和诊断以及药物开发和疾病治疗等领域得到广泛应用[8-10]。本实验采取的消减SELEX技术是一种新型的改良SELEX技术，其主要原理为SELEX筛选时去除与非特异靶标分子结合的ssDNA，然后将消减后的次级ssDNA文库作为目标靶分子结合的文库进行筛选。

另外，本研究采用的磁珠是目前一种新型的筛选介质，它是对磁珠进行一定的表征，使表面赋予新的官能团即-COOH，作为一种阴离子交换基团，与表面带正电荷的靶蛋白偶联，用于研究靶蛋白与DNA结合的特性。与普通磁性材料相比，具有较强的超顺磁性，并且修饰过的磁珠具有良好的生物相容性，易于吸附蛋白。有研究通过琼脂糖消减SELEX技术筛选得到癌胚抗原特异性单克隆抗体（Anti-CEA）核酸适配体[11]。本研究首次以肺癌血清为筛选靶标，正常血清为反筛选靶标，通过消减SELEX技术筛选得到高特异性、强亲和力的肺癌血清aptamers，可特异识别肺癌血清，为肺癌的早期诊断和早期治疗提供新的分子生物学检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

磁珠：上海西宝生物科技有限公司；随机ssDNA文库（88 nt，1.2 nmol/L）：5′-CTATAGCAATGG TACGGTACTTCC（40 N）CAAAAGTGCACGCTACT TTGCTAA-3′（N=A、G、T、C）；引物P9：5′-CTATAG CAATGGTACGGTACTTCC-3′；引物P12：5′-TTA GCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3′。引物P12（biotin）：5 ′biotin-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3 ′均由上海生工合成。

肺癌病人血清由秦皇岛市第一医院提供；正常人血清由秦皇岛市第一医院提供。1×Binding buffer（137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 6.5 mmol/L Na2HPO4, 1.8 mmol/L NaH2PO4, 2.5 mmol/L MgCl2,1 mmol/L CaCl2）。结合缓冲液：20 mmol/L HEPES，pH=7.35， 120 mmol/L KCl， 1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2；筛选缓冲液：20 mmol/L HEPES，pH=7.35， 120 mmol/L KCl， 1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2+0.05%-2%Tween20。

1.2 方法

1.2.1 血样的预处理 收集100个肺癌病人全血，在室温下3 000 r/min离心10 min去除血细胞，收集血清；然后在4 ℃条件下，15 000×g，离心30 min，除沉淀和表面油脂，收集中层清液，置–80 ℃保存待用。正常人血清的处理同上。

1.2.2 混合血清的配置 将收集到的100例肺癌血清各取50 μL混匀，制备成肺癌混合血清（消除患者之间的异质性），50 μL/管分装，–20 ℃冰箱保存备用。以同样的方法制备正常混合血清，分装后–80 ℃冻存备用。以同样的方法制备正常混合血清，分装后冻存备用。

1.2.3 正常混合血清消减SELEX筛选 取2.5 nmol/L的文库，95 ℃加热5 min，然后立即放在冰上，约20 min可以与靶标分子结合，不用时最好4 ℃条件保存，使ssDNA能形成稳定的天然构象。

取1 mL羧基化琼脂磁珠，结合600 μL正常混合血清，37 ℃，孵育2 h，弃去EP管中的正常混合血清，加入10 μmol/L tRNA，37 ℃，孵育30 min，（tRNA非特异性竞争剂进行筛选，增加筛选的特异性）, 用筛选缓冲液洗2次，1 min/次，再用结合缓冲液洗1次，1 min，结合初级ssDNA文库（95 ℃ 5 min, 4 ℃ 10 min, 37 ℃5 min，ssDNA），37 ℃，孵育1 h。弃去未结合ssDNA文库，用筛选缓冲液洗3次，1 min/次，加入200 μL去离子水，95 ℃，10 min，收集上清，作为下一轮筛选的次级库。重复上述步骤进行下一轮筛选，共进行3轮消减SELEX筛选。

1.2.4 实时定量-PCR扩增获得dsDNA dsDNA反应体系包括上游引物P9（25 pmol/μL）0.8 μL，下游引物Bio-P12（25 pmol/μL）0.8 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L）8 μL，10×buffer 10 μL，荧光染料（super greenⅠ）2 μL，模板DNA 160 μL，rTaqDNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，去离子水57.4 μL，充分混用，30 μL/管，分成8管，实时定量-PCR进行扩增[12]。S型曲线达到最高点停止扩增。

1.2.5 链霉亲和素磁珠分离次级ssDNA文库 取0.2 mL琼脂磁珠，加入500 μL 1×10–4g/L链霉亲和素，37 ℃，孵育2 h。加入200 μL经实时定量-PCR扩增后的PCR产物，37 ℃孵育30 min，弃去上清，用1 mL 1%Tween-20的PBS，40 ℃水浴5 min，重复3次，加入200 μL 1×Binding buffer ，95 ℃ 5 min，磁分离收集上清，作为下一轮筛选的次级ssDNA库。

1.2.6 反筛选 取0.3 mL磁珠于1.5 mL EP管中，偶联200 μL肺癌混合血清，作为正筛管，37 ℃，孵育2 h；取等量的磁珠于1.5 mL EP管中，偶联200 μL正常混合血清，作为反筛管，37 ℃，孵育2 h。弃去正筛管、反筛管中的血清，加入10 μmol/L tRNA，37 ℃，孵育30 min, 用筛选缓冲液洗2次，1 min/次，再用结合缓冲液洗1次，1 min/次，结合次级ssDNA文库（95 ℃5 min, 4 ℃ 10 min, 37 ℃ 5 min，ssDNA）, 37 ℃，孵育1 h。弃去未结合ssDNA文库，用筛选缓冲液洗3次，1 min/次，加入200 μL去离子水，95 ℃ 10 min，收集上清，作为下一轮筛选的次级库，重复上述筛选步骤。

1.2.7 重复筛选及筛选压力 重复上述的反筛、正筛、实时定量-PCR扩增、链霉亲和素磁珠法分离次级ssDNA文库等步骤，直至筛选文库与靶蛋白分子的结合达到饱和。在整个筛选过程中随着筛选轮数的增加，投入的ssDNA文库的量逐渐减少，而且不断的增加筛选的压力，比如逐渐减少磁珠的用量，减少孵育时间，提高ssDNA文库/磁珠结合血清比例。

1.2.8 次级核酸适配体库扩增获得dsDNA 将筛选得到的第9轮次级ssDNA库，通过实时定量-PCR扩增，扩增至S型曲线最高点停止扩增。

1.2.9 肺癌血清核酸适配体同源性分析 将上海生工生物高通量宏基因组微生物测序结果用DNAMAN软件进行同源性分析。挑选出高丰度的核酸适配体序列送上海生工合成。

1.2.10 肺癌血清核酸适配体Kd值的测定 将获得的10条核酸适配体序列送上海生工进行合成，而且将所有序列的5′端标记带有生物素。依照SELEX筛选的过程设置磁珠-肺癌血清复合物组和磁珠-正常人血清复合物组，分别投入等量的标记后的ssDNA，37 ℃孵 育 1 h， 然 后 加 入 1∶2000 稀 释 的 HRP-labeled Streptavidin，37 ℃孵育30 min，最后加入TMB显色液200 μL，37 ℃避光显色15 min，2 mol/L硫酸50 μL终止反应，酶标仪测定A450 nm值。

1.2.11 肺癌血清核酸适配体特异性鉴定 经肺癌血清核酸适配体亲和力测定分析，Seq-2、Seq-3、Seq-6、Seq-19序列亲和力最强，送上海生工进行合成。取0.1 mL磁珠于1.5 mL EP管中，标记为“1+”，偶联50 μL肺癌病人血清，37 ℃，孵育1 h；取0.1 mL磁珠于1.5 mL EP管中，标记为“1-”，偶联50 μL正常人血清，37 ℃，孵育1 h；弃去上述载体中的血清，用筛选缓冲液洗3遍，1 min/次，“1+”、“1-”EP管各结合100 μL筛选得到的肺癌血清核酸适配体（95 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min），37 ℃，孵育30 min，用1 % tween+PBS洗3遍，加100 μL纯水，95 ℃ 10 min，收集上清，实时定量-PCR检测。收集的200份肺癌血清和200份正常人血清按上述步骤进行特异性鉴定。

1.2.12 肺癌血清核酸适配体二级结构模拟分析 将筛选得到的肺癌血清核酸适配体序列，采用DNAMAN软件，依据DNA最低自由能的运算法则，进行核酸适配体二级结构预测和结构分析。

2 结果

2.1 肺癌混合血清复合靶SELEX筛选结果

2.1.1 肺癌混合血清复合靶SELEX筛选条件 共进行了9轮筛选，各轮筛选条件如表1。随着SELEX筛选轮数增多，筛选条件越来越苛刻，文库/磁珠结合血清比例不断提高，孵育时间不短缩短。消减SELEX的基本原理是从数量巨大的人工合成的随机ssDNA文库中，通过多轮循环筛选和扩增，最终筛选得到与特定靶分子特异性结合的核酸适配体。而与靶分子特异性结合的核酸适配体是受筛选条件驱动的，比如磁珠的用量，孵育时间，洗脱力度等，尤其是靶分子与ssDNA文库的比列，随着筛选轮数的增加，筛选条件是逐步趋于苛刻的。

表1 肺癌血清核酸适配体SELEX筛选条件

2.1.2 肺癌混合血清与ssDNA文库结合状况 以肺癌混合血清为靶标进行消减SELEX筛选过程中，随着筛选轮数的增加，ssDNA文库与肺癌混合血清的结合不断增多，表明能与肺癌血清结合的特异性核酸适配体不断被富集。至第9轮，ssDNA文库与肺癌血清的结合已经达到饱和，故而终止筛选（图1）。整个筛选过程用实时定量-PCR进行动态检测。

图1 实时定量-PCR检测肺癌血清核酸适配体富集结果

2.2 肺癌血清核酸适配体的Kd值

采用SELEX技术进行循环筛选，利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测筛选得到的10条肺癌血清核酸适配体与肺癌血清的亲和力。结果显示，Seq-2、Seq-3、Seq-6、Seq-19序列的亲和力较强，其中Seq-19序列的亲和力最强。

2.3 肺癌血清核酸适配体高通量测序结果

经过9轮筛选得到10个肺癌血清适配体序列（表2）。

表2 肺癌血清核酸适配体序列

图2 肺癌血清核酸适配体亲和力检测结果

2.4 肺癌血清核酸适配体同源性及进化树分析结果

高通量测序后，利用DNAMAN软件对10条肺癌血清核酸适配体进行多序列比对和同源性分析。如表2所示，测序结果与预期长度一致，其同源性达66.98%。获得的核酸适配体富含G、C序列，且同源性较高。另外结合进化树分析，获得的核酸适配体按照同源性主要分为3个家族F1、F2和F3（图3）。

图3 肺癌血清核酸适配体同源性及进化树分析结果

2.5 肺癌血清核酸适配体二级结构预测

用DNAMAN软件预测筛选到的肺癌血清核酸适配体的二级结构。显示核酸适配体有丰富的二级结构。主要以茎环结构（Loop-stem）、茎凸环结构（bulge）为主。

2.6 肺癌血清核酸适配体特异性鉴定结果

200份肺癌血清、200份正常人血清分别与4条肺癌血清核酸适配体的特异性鉴定结果如图5，与肺癌血清孵育后结合的ssDNA的Ct值与正常人血清孵育后结合的ssDNA的Ct值的差值，即ΔCt值，鉴定结果表明4条肺癌血清核酸适配体的ΔCt值都在4～5个循环左右，说明我们成功筛选得到高特异性、强亲和力的肺癌血清核酸适配体。

图4 部分肺癌血清核酸适配体二级结构预测图

图5 肺癌血清核酸适配体特异性鉴定结果

3 讨论

自1990年SELEX技术首次建立以来，该技术得到不断丰富和发展，在各研究领域也显示出良好的应用前景[16-18]。近年来在经典SELEX技术基础上，发展了多种SELEX新技术，如复合靶SELEX，消减SELEX，细胞SELEX等[13-15]。复合靶SELEX技术可以筛选出完整细胞复合靶标中多种分子的特异性核酸适配体[19-20]，并且相互不干扰；消减SELEX技术可将两个同源的符合靶标中共同分子的核酸适配体分子先进行消减，进而高效获得差异靶分子的特异性核酸适配体。

SELEX筛选所用的随机寡核苷酸文库常用的有ssDNA文库和RNA文库。ssDNA文库稳定性好，易变性和复性，可长期保存。RNA文库空间结构丰富，与不同靶分子结合的特异性更强，但易受RNA酶降解[21-23]。血清中含有大量的RNA酶，所以限制了RNA文库在血清核酸适配体筛选中的应用。

利用消减SELEX技术筛选核酸适配体的方法，采用（次级）库结合磁珠，经过孵育、洗涤、洗脱；经过PCR扩增负链带有亲合素的dsDNA；磁珠链霉亲合素制备ssDNA次级库，同样经过经过孵育、洗涤、洗脱；实际操作每轮筛选就只有两次孵育、洗涤、洗脱和一次的PCR，再通过每轮的富集检测和二代基因高通量测序确认富集程度和准确获得较全面的富集核酸适配体。其优点是成本较低、操作简单、快速、准确、全面等，并且能有效的消减血清中高丰度蛋白，去除非特异ssDNA的富集，筛选效率得到有效提高，其筛选得到的核酸适配体具有结构多样性。本研究采用磁珠链霉亲和素制单链具有效率高，采用PCR方法制备单链的复杂繁琐，以及人为因素的干扰和不确定性。利用基因二代次序技术对次级库进行测序，能较准确全面得到高效富集核酸适配体，避免了克隆后测序，造成核酸适配体的丢失和不完整。另外，还可以通过筛选得到的高特异性的核酸适配体组直接通过实时荧光定量-PCR检测待测样本血清，该实验过程耗时不足50 min，同时免去传统检测ELISA中的反复洗板过程，成为本研究的最大亮点。利用RNAstructure模拟核酸适配体的二级结构，结果显示核酸适配体主要以茎环和口袋结构为主，提示这可能是核酸适配体与肺癌血清蛋白结合的结构基础。

血清是体外诊断研究的最佳标本，同时，肿瘤标志物的检测是临床上唯一的无创性诊断手段[24-26]。肺癌作为严重威胁人类健康及生命的恶性肿瘤之一，受到人们的高度关注，早期诊断和早期治疗是提高肺癌患者存活率的关键。本研究针对多项肺癌血清肿瘤标志物，通过SELEX技术筛选其aptamers，建立一种利用特异性寡核苷酸适配体组，同时检测多种肺癌血清肿瘤标志物的分子生物学检测新技术，从提高诊断的准确度和灵敏度[27]。同时，利用SELEX技术筛选得到未知的肺癌血清肿瘤标志物，最终建立肺癌早期、中期、晚期血清标志物谱库[26-30]，为肺癌的早期诊断和早期治疗提供新的突破口。