北京港口水产品中非O1/O139群霍乱弧菌MLST分型研究

付溥博， 张 琳， 曾 静， 张西萌， 魏咏新， 魏海燕， 耿 荣

(1.北京出入境检验检疫局， 北京 朝阳 100026 ； 2.河北出入境检验检疫局， 河北 石家庄 050051)

霍乱弧菌为革兰阴性菌，是人类霍乱病的病原体。根据霍乱弧菌O抗原的不同，可分为210多种血清型，过去O1和O139型被认为是引起霍乱流行的主要血清型[1]，所以在检验霍乱弧菌时，常常检验此2种血清型，但随着研究的深入，人们发现非O1/O139群霍乱弧菌也会导致疾病[2]。非O1/O139群霍乱弧菌是指除O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌以外的霍乱弧菌[3]，是一种全世界都有分布的水生性细菌，广泛存在于自然界的水体中，常常在水体或水产品中检出。近年来，越来越多的研究表明，散发或局部暴发的腹泻是由非O1/O139群霍乱弧菌引起的，此类菌群引起了细菌学家们越来越多的关注[4]。

多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)起源于多位点酶凝胶电泳(Multilocus enzyme electrophoresis,MLEE)[5]，是一种针对微生物群体中缓慢基因位点变异进行分型的方法。此方法较简单快速，有着较高的分辨率，最主要是其可以通过互联网实现实验室间数据的共享与比较，并利于实验结果的保留，实验结果可与多年前的数据相比较[6]。此方法正逐渐被认作沙门、耶尔森等细菌分子分型的“金标准”[7]，有部分学者认为此方法是进行流行病学研究最为可靠的工具[8-9],其结果比脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法有着更好的分辨率[10]。本研究采用现有的MLST标准程序，对本实验室保存的67株分离自进出口水产品中的霍乱弧菌进行分析，并汇总MLST数据库中菌株信息，进行了基因分型和系统进化的分析。

1 材料与方法

1.1 材料 67株霍乱弧菌为本实验室保存的分离自2007-2011年北京港口进出口水产品中的菌株。所有菌株活化后，经VITEK 2 Compact鉴定符合霍乱弧菌的生化特征，经血清试验验证均为非O1非O139血清型。菌株来源见表1。

表1 菌株来源与ST型

1.2 仪器与试剂 PCR仪(美国罗克韦尔自动化公司)；水平式核酸电泳仪和凝胶成像分析仪(美国伯乐生命医学产品有限公司)。

碱性蛋白胨水(Alkaline Peptone Water ,APW)(北京陆桥生物技术有限责任公司，161207)；荧光PCR用引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(20161018)；7对管家基因引物，由宝生物工程(大连)有限公司合成(20170108)；TaqDNA聚合酶PCR试剂盒(普洛麦格生物技术有限公司，20170517)。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA的提取 将保存菌株在APW中培养过夜，取菌悬液1 mL于Eppendorf管中，10 000 r/min离心2 min，弃去上清，加50 μL无菌水，煮沸裂解10 min，冰浴5 min，10 000 r/min离心2 min，上清液即为DNA模板。立即用于PCR扩增或短期保存于-20 ℃。

1.3.2 致病基因的检测 应用实时荧光PCR检测菌株的CTX、toxR和hlyA基因，其20 μL体系为：10 μL 2 ×TaqMan Universal Master Mix，目标菌上游引物、下游引物(10 μmol/L)各1 μL:，探针(10 μmol/L)1 μL，模板50 ng ～100 ng，用灭过菌的双蒸水补足20 μL。引物探针具体序列见表2。PCR反应条件：50 ℃，2 min； 95 ℃，10 min；95 ℃，15 s； 60 ℃,60 s；40个循环。反应体系为20 μL。具

表2 致病基因检测用引物探针

1.3.3 MLST目标基因的选择和引物的设计 选择霍乱弧菌的adk、gyrB、metE、mdh、pntA、pyrC、purM7对管家基因作为MLST分析基因。PCR 扩增和测序引物引用http://pubmlst.org/vcholerae/info/primers.pdf 网站上发表的PCR引物序列。

1.3.4 PCR 扩增体系与条件 PCR反应50 μL体系包括：双蒸水38 μL，TaqDNA Polymerase(5 U/μL)1μL，PremixExTaqTM(10×, 含Mg2+) 5 μL,dNTP 1 μL,上游引物、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，模板DNA 3 μL。PCR反应条件：96 ℃预变性10 min；96 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，70 ℃延伸1 min，30次循环后70 ℃延伸10 min。扩增产物在加入溴化乙锭(EB)的1%琼脂糖凝胶上电泳，后在成像仪的紫外光下观察扩增效果。

1.3.5 管家基因的测序及序列分析 将条带单一且位置正确的PCR产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。将测得序列与NCBI上查询到的7种管家基因的进行比较，应用软件DNAStar-MegAlign7.0将测得的序列裁剪到合适的大小。将裁剪好的序列按adk-gyrB-mdh-metE-pntA-purM-pyrC的顺序进行拼接，应用软件DNAStar-SeqMan 7.0 连接为3 215 bp的片段。将所得片段提交至MLST数据库比对，获取等位基因谱(Allele profile)和序列型(Sequence types，STs)。若发现新的等位基因及ST，则将新的信息上报至管理员，以获得等位基因号码和ST号码。应用eBURSTv3.0软件对我实验室分离菌株的STs和pubmlst上的数据，进行克隆群(Clonal Complex，CC)、组(Groups)和单体(singletons)分析；并应用goeBURST软件进行分析。

2 结果

2.1 致病基因CTX、toxR、hlyA检测结果 67株菌株针对CTX、toxR、hlyA3种毒力基因扩增结果均为阴性。

2.2 管家基因扩增结果 所有菌株均扩增出7个管家基因位点的目的片段结果，扩增产物的核酸浓度及纯度均符合测序要求。

2.3 霍乱弧菌MLST分型结果 将等位基因谱提交至MLST网站,结果显示，67株霍乱弧菌可分为62个STs。其中原有STs 2个，新发现STs 60个。其中相同的ST型有ST377 2株，均来源于中国；ST380 3株，均来源于中国；ST383 2株，均来源于泰国；ST388 2株，均来源于中国。原有ST型为ST271、ST338；新发现STs经MLST网站管理员确认编号为ST369～ST428。

2.4 本试验结果与pubmlst数据库相比较的eBURST分析结果 由于本试验用菌株均为非产毒株，基因变异性较大，分布分散(图1)。用Seqman软件分别对这些菌株的7对管家基因进行分析，其基因相似度分别为90.4%～100%(adk)、91.8%～100%(gyrB)、88.6%～100%(mdh)、94.0%～100%(metE)、96.6%～100%(pntA)、41.9%～100%(purM)、86.5%～100%(pyrC)，用Mega 7.0 分别对这7对管家基因进行系统发生分析，用Neighbor-Joining(NJ)法绘制进化树，其中adk、gyrB、mdh、metE、pntA、pyrC基因相似度较接近，结果以adk可以为例见图2，purM基因差异最大，结果见图3。以上结果说明这些菌株的管家基因，尤其是purM基因发生了较大的遗传变异。继续将pubmlst数据库中全部霍乱弧菌的STs进行分析，截止到2017年2月，数据库中霍乱弧菌共有STs 505个，做eBURST分析，本实验数据与数据库中数据可归为7个组别(图4)。其中明显成克隆群的CC71-75、CC176-173、CC430，根据Pubmlst数据库中信息可知，均为产毒株。根据上面数据分组情况，将Pubmlst数据库中(包括本实验数据)与本实验相关的数据做goeBURST分析，共将71个STs归为7个组别(图5)，其中方形框为本实验室结果具体结果为ST-88～ST-8～ST-384，其中菌株来源于中国和澳洲，本试验结果为ST-384，来源于中国；ST-423～ST-204～ST-294，其中菌株来源于泰国和法国，本试验结果为ST-423来源于泰国；ST-403～ST-267，其中菌株均来源于中国，本试验结果为ST-403，来源于中国；ST-411～ST-15，其中菌株来源于中国和澳洲，本试验结果为ST-411，来源于中国；ST-416～ST-205，其中菌株来源于中国和泰国，本试验结果为ST-416，来源于中国；ST-338～ST-348，其中菌株来源于中国和非洲，本试验结果为ST-338，来源于中国；ST-385～ST-326，其中菌株来源于中国和法国，本试验结果为ST-385，来源于中国。

图1本试验STs的eBURST分析结果

注：每个圆点代表一个ST型，上标数字即为其具体的ST型

图2adk基因的NJ进化树

图3purM基因的NJ进化树

图4Pubmlst数据库中STs的eBURST分析结果

图5Pubmlst数据库中的相关STsgoeBURST分析结果

3 讨论

早期研究认为，霍乱弧菌的致病基因主要为CTX基因，但也有毒力基因阴性却引发腹泻暴发的病例[11]。近年来，越来越多的研究表明，散发或局部暴发的腹泻是由非O1/O139群霍乱弧菌引起的，此类菌群引起了科研人员越来越多的关注[4]，研究人员发现，非O1/O139群霍乱弧菌相比O1、O139群霍乱弧菌的菌体多糖分泌的变异，使得前者能形成生物膜，从而能更好的抵御不良环境，更适于在其在水产品中生存与繁殖[12]，而在外界某些条件的作用下非O1/O139群霍乱弧菌会通过抗原漂移来获得毒力基因[13]。故此只有对霍乱弧菌的分子分型进行深入的研究，才能了解该细菌的分型特征及进化、以及溯源情况，并避免产品间或实验室内的相互污染。

本试验共从非O1/O139群霍乱弧菌中新发现了60个STs，通过对结果应用eBURST、Paup4.0和goeBURST软件进行分析可以看出，本试验的菌株没有成组，均为单体，将本实验的ST结果与Pubmlst数据库中相关的ST一起进行MLST分析，本次试验的结果也并没有与数据库中数据成群的ST型，形成7组，这与本实验室样品来源较广，菌株分离自世界各地的水产品有关。而且，本试验菌株均为非产毒株，也说明环境非产毒株基因的变化要大于产毒株，此结论与此前有学者报道的“非产毒性霍乱弧菌基因组间差异较大”相符[1]。

应用MLST方法对霍乱弧菌进行研究是较新兴的项目，自2013年4月29日开始建立霍乱弧菌的数据库，迄今此数据库中数据尚不够完善，对分组造成了较大影响。在Pubmlst霍乱弧菌数据库建立之前，有学者对霍乱弧菌进行MLST分析时，选取了与现数据库不同的管家基因，据报道共涉及了管家基因40个[14]，从而导致了无法与很多早些时候的学者们研究成果相比较，也说明了充分丰富这种全球数据库的重要性。

从本次试验结果来看，具有相同ST型的菌株均来源于相同国家，这说明MLST方法擅长于显示不同地理区域的菌株的进化关系，此方法可以建立一个可靠的食品污染溯源体系，也说明进化有一定的地域性；而成组的ST型则来源于中国、泰国、澳洲、非洲和法国，说明不同地理来源的菌株也可能有着类似的克隆株，说明随着国际贸易的日益发展，不同大洲之间的细菌正发生着基因的水平转移。

但在对Pubmlst数据库中的霍乱弧菌进行研究时发现，霍乱弧菌没有像其他致病菌那样，产不同毒素的菌株或不同血清型会明显成不同群。有学者就曾报道，由于霍乱弧菌产毒菌株的高度克隆化，使得MLST方法对其致病血清的分析效果并不理想[15]，这也是今后研究中值得注意并要解决的问题。

总之，本试验利用MLST这种操作简单、易于保存数据，便于比较不同实验室间的结果，擅长于显示不同地理区域的菌株的进化关系分子方法，对保存的67株霍乱弧菌进行了分子特征的分析，发现了新的ST型，并向Pubmlst数据库上传了数据，扩充了数据库。通过分析，发现本次试验数据的克隆组，主要来源于不同国家，有遗传多样性；进境水产品中分离菌株多为单体，但相同ST型来源地一致。