棘腹蛙TGF-α基因的克隆与组织表达分析

邹 勇， 李晓英,2， 罗 洁 ,2， 樊汶樵,2

(1.重庆文理学院,重庆 永川 402168 ； 2.重庆珍稀濒危水产资源保护与开发研究中心,重庆 永川 402168)

转化生长因子(Transforming Growth Factor，TGF)超基因家族因为在细胞发育、表皮形成、组织修复、癌症发生和免疫等方面发挥的重要作用，一直以来都是研究的热点[1]。TGF-α被发现参与癌症的转移与分化[2-3]，通过调控TGF-α的表达量，可以控制星形胶质细胞的形成[4]；TGF-α和表皮生长因子受体(EGFR)共同作用，可增强流感病毒感染时机体的先天免疫反应[5]。

棘腹蛙(Paaboulengeri)又名石坑、石蛙等，属无尾目、蛙科、棘蛙属，是我国西部中高海拔区域特有的珍稀两栖动物[6-7]。由于环境污染、生态破坏等原因，野生棘腹蛙的规模日趋萎缩，现已被《中国濒危物种红皮书》[8]、《中国物种红色目录》[9]等收录。为保护资源和满足经济需求，棘腹蛙人工养殖日渐火热，人工饲养的子二代市场价格达180～280元/kg，已成为山区农民脱贫致富的重要途径。

本研究拟从前期转录组测序获得的信息入手，克隆TGF-α基因，对其进行生物信息学分析并了解其组织表达特性；为深入了解TGF家族的特征，尤其是物种特异性的潜在功能作用位点，探索棘腹蛙的生理反应和机体免疫机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验试剂和耗材 2岁龄健康棘腹蛙，饲养于重庆珍稀濒危水产资源保护与开发研究中心两栖动物流水养殖系统。TRIZol、DEPC，购自上海生工生物工程技术服务有限公司，cDNA合成试剂盒、Taq酶、PCR纯化试剂盒采，购自Promega公司；凝胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；DL-2 000 DNA；Marker,购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 引物设计与合成 基因序列主要基于前期本实验室建立的棘腹蛙蝌蚪的Illumina solexa第二高通量转录组数据库，采用RT-PCR获取棘腹蛙TGF-α的全长基因序列(上下游引物序列：5′- TGGTATTTGGTTTTCATCATTGGCT -3′， 5′- GAGCATTCAAAGAACAATCAAACCC -3′)，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 序列验证 小心摘取棘腹蛙皮肤组织，立即放入液氮中。随后按试剂盒说明书抽提总RNA，并利用cDNA合成试剂盒说明书完成cDNA的制备。利用TaqDNA酶进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶回收试剂盒进行回收。阳性产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。在GenBank数据库中检索其他物种TGF-α同源序列，利用ClustalX 1.83对阳性测序结果进行多重序列比对。

1.4 组织表达分析 根据阳性克隆的TGF-α序列，设计实时荧光定量PCR特异性引物(上游引物：5′-GGGGTGACTTGTCCATC-3′，下游引物：5′-CACTGCCGCTGCTACTG-3′)，同时根据实验室自测的转录组数据设计内参基因β-Actin特异性引物(上游引物：5′-CTGTGCCAATCTATGAGGG-3′，下游引物：5′-CGGCTGTGGTGGTGAAG-3′)。以在21 ℃环境下适应生长30 d的棘腹蛙组织(皮肤、血液、胃脏、肝脏、胆囊和肠道)cDNA为模版，利用Real-time PCR(LightCycler Nano System，Roche，德国)分别扩增TGF-α和β-Actin，检测TGF-α在各组织中的相对表达量。

根据荧光定量试剂盒(Faststar essential DNA Green Master，Roche，德国)说明书配制20 μL 的反应体系。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 10 s，52 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。

2 结果

2.1 TGF-α-Pb基因的扩增 棘腹蛙TGF-α基因(TGF-α-Pb) cDNA全长序列及推测编码的氨基酸序列见图1。cDNA全长1 021 bp，包括188 bp的5′非翻译区，486 bp的开放阅读框及347 bp的3′非翻译区；开放阅读框编码161个氨基酸，预测分子质量为17.28 kDa，等电点为6.27。

2.2 氨基酸序列比对 将TGF-α-Pb的氨基酸序列与其他脊椎动物TGF-α的氨基酸序列进行同源性分析和多序列比对，结果见图 2。分析表明，TGF-α-Pb与非洲爪蟾(Xenopuslaevis)TGF-α的相似性最高，为73%；与热带爪蟾(Xenopustropicalis)、西部锦龟(Chrysemyspictabellii)、鬼狒(Mandrillusleucophaeus)、 家兔(Oryctolaguscuniculus)、人(Homosapiens)和水牛(Bubalusbubalis)的 同 源 性 分 别 为 71%、71%、71%、67%、69% 和65%。

图1TGF-α-PbcDNA全长序列和预测的氨基酸序列分析

注：开放阅读框486bp，编码161个氨基酸。起始密码子和终止密码子分别用黑体单下划线和黑体双下划线表示

图2棘腹蛙与其他物种TGF-α氨基酸序列比对结果

注：比对所用到的物种和 GenBank 登录号： 虹鳟，XP_011822612.1；人，AAF05091.1； 家兔，XP_008252499.1； 水牛，XP_006049306.1；西部锦龟，XP_005285272.1； 非洲爪蟾，NP_001088773.1；热带爪蟾，XP_002935348.1

2.3TGF-α-Pb在不同组织的差异表达 用相对定量PCR的方法分别检测了TGF-α-Pb在皮肤、血液、胃脏、肝脏、胆囊和肠道组织中的表达量，结果显示，TGF-α-Pb在各组织中均有表达，在肝脏和胃脏中的表达量较高，在肠道、皮肤和血液中的表达量相对较低，结果见图3。

3 结论

本试验成功克隆了棘腹蛙TGF-α基因的全长cDNA序列，对其氨基酸序列通过多序列比较发现，其与其他物种TGF-α相似性相对较低，显示出该基因在进化上的特异性。利用实时荧光定量PCR方法对该基因在皮肤、血液和主要消化器官中的表达情况进行分析，发现肝脏和胃中有该基因相对表达量较高，可能是该基因编码蛋白产生作用的主要靶器官。

图3TGF-α-Pb在不同组织中的差异表达量