ABCG2基因rs3114018单核苷酸多态性与武陵山地区痛风及高尿酸血症的相关性研究①

夏 燕 陆光辉 黄 琼 田 瑞 向 阳 向诗非 连思懿 向方华 袁 林

(湖北民族学院风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，恩施 445000)

原发性痛风是由于单钠尿酸盐晶体沉积在关节及周围结缔组织而引起的炎症反应。 其中，高尿酸血症是痛风发生和痛风石形成的生化基础，然而并不是所有的高尿酸血症患者最终都会发展为原发性痛风。研究表明，除了饮食、肥胖等后天因素外，遗传因素是痛风和高尿酸发病的另一个重要因素[1,2]。多个全基因组关联研究显示，尿酸盐转运体的基因多态性与血尿酸水平升高和痛风相关[3-5]。ABCG2 基因是编码表达于肾近曲小管刷状缘膜上的重要尿酸盐转运基因[6]，研究显示，ABCG2 基因多态性与血尿酸水平升高和痛风发病密切相关，其中Q126X(rs72552713)和Q141K(rs2231142)两个错意突变位点，在前期研究中被认为是原发性痛风及高尿酸血症的易感位点[7-9]，SNP rs3114018是ABCG2另一个错意性突变位点，近来有研究发现其可能与痛风发生相关[10-12]，但是其与高尿酸血症的相关性研究未见报道。湖北恩施土家族苗族自治州地处武陵山区，痛风和高尿酸血症的发病率逐年上升。本研究欲探索武陵山地区人群中ABCG2基因单核苷酸位点rs3114018多态性与原发性痛风、高尿酸血症的相关性。

1 资料与方法

1.1研究对象 选择2015年10月至2016年12月在湖北民族学院附属民大医院体检中心体检的高尿酸血症、风湿免疫科的原发性痛风患者及同期无高尿酸血症及痛风家族病史的健康体检者为研究对象，共452例，其中高尿酸血症188例，男性147例；痛风患者158例，男性153例；健康对照组106例，男性53例。高尿酸血症均经过临床及实验室检查确诊，男性血清尿酸≥416.4 μmol/L，女性血清尿酸≥356.9 μmol/L，且排除明确诊断痛风、肿瘤、肾功能不全、严重全身系统性疾病及近期服用过容易引起血尿酸水平上升药物的患者。痛风患者均符合1997年美国风湿病学会制定的原发性痛风的诊断标准，排除肾脏疾病、肿瘤等引发的继发性痛风患者。本研究经医院医学伦理学委员会批准，所有研究对象均知情同意。

1.2方法

1.2.1临床资料采集、生化指标检测 分别用抗凝管和分离胶管采集各受试人群空腹静脉血 3 ml，其中分离胶管采集血液由医院检验科检测分析肝肾功能及血常规。

1.2.2DNA 提取 取空腹静脉血EDTA-K2抗凝，3 000 r/min 离心3 min，采用离心吸附柱法，按照TIANamp Blood DNA Kit(天跟公司) 说明书操作提取 DNA，提取的 DNA 样品用One Drop超微量紫外分光光度计(南京五义科技有限公司)检测，吸光度(A260/280 nm) 值在 1.5～2.0，浓度 >50 ng/μl的 DNA 样品用于后续实验。

1.2.3基因多态性检测 本实验采用Hi-SNP结合多重PCR技术和高通量测序技术(上海翼和应用生物技术有限公司)根据 GenBank 中 ABCG2 基因序列，用在线Primer 3.0 软件设计特异性引物，上游引物序列:5′-CCTTCAGCCACTGAGGAAAAG-3，下游引物序列:5′-ACTCTTTCTTGGGTACTTTAGCTCTA-3′。在单管内进行多重PCR扩增，不同的样本以不同的Barcode引物区分。混合样本后，在Ion Proton/illumina 主流测序平台上，对扩增子进行高通量测序。

2 结果

2.1ABCG2基因rs3114018(A/C)位点的HWE平衡检验 结果显示ABCG2基因的rs3114018位点在各组中均符合Hardy-Weinberg平衡(高尿酸血症、痛风和健康对照组χ2值分别为0.366、0.005和0.942，P值均大于0.05)，因此样本具有群体代表性。

2.2临床资料分析 痛风组和高尿酸组与正常组间三酰甘油和总胆固醇差异均无统计学意义。原发性痛风和高尿酸血症组血糖、 血肌酐、白细胞、谷丙转氨酶及谷草转氨酶均显著高于正常组(P<0.05)。而原发性痛风组谷丙转氨酶、血肌酐、总胆固醇和白细胞与高尿酸组相比有显著差异(结果见表1～3)。

2.3ABCG2基因rs3114018多态性与痛风和高尿酸易感性的关联分析 高尿酸血症组rs3114018 位点AA、AC、CC基因型频率分别为12.76%、 43.09%、 44.15%；正常组中其基因型频率分别为15.09%、48.12%、36.79%，两组基因型比较差异无统计学意义(χ2=1.536，P=0.464)。采用Logtistic回归比较分析，发现CA和CC基因型均未增加高尿酸血症患病风险。痛风组ABCG2基因rs3114018位点AA、AC、CC基因型频率分别为 4.41%、32.70%、62.89%，与对照组基因型频率分布相比差异有统计学意义(χ2=20.52，P< 0.001)(表4)。采用Logistic回归比较分析，发现CC基因型使得发生痛风的风险提高了5.861倍(95%CI:2.239～15.340,P<0.001)，其中C等位基因型与痛风发生的相关性为2.461(95%CI:1.671～3.622,P<0.001)。对性别因素进行校正,校正后rs3114018位点CC基因携带者痛风发病风险提高了5.540倍(结果见表5)。

2.4ABCG2基因 rs3114018多态性与痛风易感性的关联分析 rs3114018基因型AA、AC和CC在痛风组和高尿酸血症组中基因频率分布存在显著差异(χ2=14.91，P=0.001)，痛风组C等位基因频率占79.25%，较高尿酸血症组差异具有统计学意义(χ2=15.666，P<0.001)。经过分析，rs3114018 CC基因型使痛风的发生风险增加了4.131倍(95%CI:1.695～10.067,P=0.002)，C等位基因能够使痛风的发病风险增加1.994倍(95%CI：1.413～2.815，P<0.001)，而AC基因型与痛风发生没有显著相关性。调整性别影响因素后，差异具有统计学意义(结果见表6)。

表1高尿酸组与正常组临床资料比较

Tab.1Comparisonofsubjectcharacteristicsofhyperuricemiagroupwithcontrol

GroupsALT(U/L)AST(U/L)CREA(μmol/L)TC(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)WBC(×109/L)Control20 35±1 5720 24±0 6973 63±1 434 91±0 175 04±0 061 70±0 415 62±0 18Hyperuricemia36 38±1 7427 93±0 9986 73±1 285 16±0 075 38±0 062 09±0 106 35±0 11t6 816 356 421 433 471 323 48P0 0000 0000 0000 1520 0010 1870 001

表2痛风组与正常组临床资料比较

Tab.2Comparisonofsubjectcharacteristicsofgoutgroupwithcontrol

GroupsALT(U/L)AST(U/L)CREA(μmol/L)TC(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)WBC(×109/L)Control20 35±1 5720 24±0 6973 63±1 434 91±0 175 04±0 061 70±0 415 62±0 18Gout30 16±1 5426 97±1 25102 09±2 934 83±0 105 63±0 112 18±0 206 99±0 23t4 434 698 710 364 541 104 59P0 0000 0000 0000 7140 0000 2710 000

表3痛风组与高尿酸组临床资料比较

Tab.3Comparisonofsubjectcharacteristicsofgoutgroupwithhyperuricemiagroups

GroupsALT(U/L)AST(U/L)CREA(μmol/L)TC(mmol/L)GLU(mmol/L)TG(mmol/L)WBC(×109/L)Hyperuricemia36 38±1 7427 93±0 9986 73±1 285 16±0 075 38±0 062 09±0 106 35±0 11Gout30 16±1 5426 97±1 25102 09±2 934 83±0 105 63±0 112 18±0 206 99±0 23t2 5250 5675 1352 5161 8890 3742 542P0 0120 5710 0000 0130 060 7090 012

表4高尿酸组、痛风组与正常组ABCG2基因rs3114018位点基因型等位基因频率分布的比较

Tab.4Comparisonofdistributionofalleleofrs3114018ofgoutandhyperuricemiagroupwithcontrol

GroupsGenotype(n)CCACAAχ2PAllele(ratio)CAχ2PControl395116129(60 85%)83(39 15%)Gout10052720 52<0 001252(79 25%)66(20 75%)21 30<0 001Hyperuricemia8381241 690 430247(65 69%)129(34 31%)1 3790 240

表5ABCG2基因rs3114018多态性与痛风和高尿酸易感性

Tab.5Associationbetweenhyperuricemiaandgoutandgenepolymorphismswithcontrolwhilecontrollingsex

ParameterOR95%CILowerUpperPOR1)95%CI1)LowerUpperP1)HyperuricemiaAC1 0590 5142 1820 8770 9730 4562 0770 943CC1 4190 6782 9680 3531 3400 6192 9040 458AC+CC1 2150 6142 4050 5761 1310 5532 3140 735GoutAC2 3310 8856 1390 0872 0500 6816 1720 202CC5 8612 23915 3400 0005 5401 83416 7350 002AC+CC3 8601 5309 7420 0043 5071 22310 0550 020

Note：1)Adjusted for sex.

表6ABCG2基因rs3114018多态性与痛风易感性的关联分析

Tab.6Associationbetweengoutandgenepolymorphismswithhyperuricemiawhilecontrollingsex

GnetypeOR95%CILowerUpperPOR1)95%CI1)LowerUpperP1)AC2 2010 8855 4740 0902 1090 8305 3550 117CC4 1311 69510 0670 0024 0491 62610 0840 003AC+CC3 7481 6118 7200 0023 0801 2657 5030 013

Note：1)Adjusted for sex.

3 讨论

ATP结合盒蛋白亚家族G成员2(ATP-binding cassette,subfamily G,member 2,ABCG2)是ATP结合盒转运蛋白家族的一员，基因位于4q22.1，长67 171 bp，编码655个氨基酸，相对分子量72 343，最早被认识是因其参与了肿瘤细胞的耐药性产生，因此又被称为乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein BCRP,BCRP)，是导致肿瘤多药耐药的重要机制之一[13]，Woodward等[14]研究证实ABCG2作为一种转运蛋白及尿酸分泌蛋白，广泛分布在具有分泌和排泄功能的组织。现在多项对 ABCG2 的全基因组关联研究证实 ABCG2转运蛋白与体内血尿酸水平和痛风发病率之间存在相关性，其功能紊乱会增加痛风和高尿酸血症的发病风险[15-17]。Nakayama等[18]研究发现除了性别因素外，基因变异引起的ABCG2功能障碍对高尿酸血症的发展影响要比其他常见的危险因素如肥胖和酗酒等要大得多。rs3114018是ABCG2基因的单核苷酸多态位点，定位于ABCG2 基因的内含子区域，ABCG2基因rs3114018单核苷酸多态位点对ABCG2基因功能的影响尚不清楚，研究认为虽然内含子区域不直接参与蛋白的编码，但是其可能通过影响RNA的剪接，从而影响ABCG2蛋白的功能或表达[19]。

近年来研究发现痛风患者rs3114018基因多态性与尿酸水平间存在显著相关性，携带CC基因型的痛风患者尿酸水平明显高于AA/AC基因型患者[10],Yu等[12]研究发现与正常组相比，C等位基因可能使痛风发病的风险增加。本研究发现ABCG2基因rs3114018位点多态性与恩施地区痛风发病相关，与高尿酸血症没有显著的相关性。痛风组AA、AC、CC基因型与正常组和高尿酸血症组相比有明显差异，其中C等位基因型与痛风发生具有相关性，CC基因型携带者与对照组相比痛风发生风险提高了5.861倍，与高尿酸组相比痛风发病风险提高了4.131倍。为了去除混杂因素对基因与痛风的影响，调整了痛风组与正常组中性别、血糖、 肌酐、白细胞、谷丙转氨酶及谷草转氨酶等差异因素，发现CC基因型与痛风仍具有相关性(OR=7.505，95%CI：1.884～29.905,P=0.004)；同时调整痛风组和高尿酸血症组中谷丙转氨酶、肌酐、血清总胆固醇和白细胞等差异因素后，CC基因型仍然使痛风发病的危险性上升了3.039倍(95%CI:1.064～8.681,P=0.038)。而对比分析高尿酸血症与正常组发现，两组基因型比较差异无统计学意义,CA和CC基因型均未增加高尿酸血症患病风险(P<0.05)，C等位基因也与高尿酸血症的发生没有明显相关性。

由此我们推测ABCG2 rs3114018位点单核苷酸多态性可能与武陵山地区原发性痛风的发病相关，与高尿酸血症没有显著相关性，提示该位点可能成为恩施地区人群痛风筛查的一个遗传标志。虽然我们发现rs3114018位点与痛风的发生相关，但是并不能解释其在痛风中的发病机制。另外，考虑到不同种族SNP等位基因频率不同，以及本研究涉及样本量相对较少，可能会使结果存在一定的偏差，需要更多的实验研究来完善。