沙棘多糖对扑热息痛诱导的小鼠肝损伤保护作用的研究①

王昕旭 王 雪 张晓慧 邹 凯 刘春妍 颜 妍 王玉珍 赵世敏

(内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特 010018)

沙棘(Hippophae rhamnoides,Linn.)，为胡颓子科沙棘属植物,落叶灌木或小乔木，又名醋柳、酸刺等。沙棘果中营养物质十分丰富，其许多成分在肿瘤的预防治疗以及增强免疫力、抗衰老、防止血管栓塞等方面有着很好的效果，具有很高的药用价值[1]。多糖是有机体必需物质，与维持生物机能密切相关，而天然多糖具有抗氧化、抗菌、抗病毒等许多生物学功能，近年来也受到了广泛的重视和研究，其中又以植物多糖研究最为广泛[2-5]。《中医大辞典》记载沙棘果有活血散瘀、化痰宽胸、补脾健胃、生津止渴、清热止泻等之功效。目前，对于沙棘也进行了一些研究[6]，但对于其多糖的研究并不广泛，在药物性肝损伤方面的研究也不是很多，所以，本实验以从沙棘果中提取的沙棘多糖(Seabucthorn polysaccharide,SP)为研究对象，探究其在扑热息痛(Acetaminophen,APAP)诱导的小鼠药物性肝损伤组织中的保护作用。

APAP是临床上一种常见的非抗炎解热镇痛药，在其规定的剂量范围内，其治疗效果良好且无副作用，如若超过其服用剂量，则会造成严重的急性肝损伤以及肾功能衰竭，严重的患者还可导致死亡。在发达国家，APAP导致的急性肝损伤的发展趋势迅猛，已经在一定程度上影响了人们的生活质量。其中对于那些常规治疗无效者，肝移植是唯一挽救的方法[7]，不过，即使在满足标准的患者中，超过20%将在1年内死亡，而一半患者将在未来10年内死亡[8]。由此可见，APAP所引起的肝损伤情况并不乐观，所以，对于药物性肝损伤的预防与治疗也尤为受到关注。

药物性肝损伤是一个多因素多机制的复杂过程，其发病机制不仅与氧化应激有关，炎症反应在其发生、发展进程及预后中也起到重要作用[8]。肝脏是人体重要的免疫器官，在药物性肝损伤发病过程中，炎症反应是造成肝损伤的主要原因和重要机制之一[9]，其主要促成因素是Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)，TLR通过与配体结合诱导肿瘤坏死因子-α(Tumor necroisi factor α,TNF-α)、IL-1β和IL-6等促炎性细胞因子的产生,从而加剧药物性肝损伤的发生[10]。

1 材料与方法

1.1实验动物、试剂 8周龄雄性C57BL/6小鼠40只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司;APAP和NAC购自阿拉丁试剂公司;组织蛋白提取液购自康为世纪生物有限公司;BCA 蛋白质定量检测试剂盒购自上海生物工程有限公司；总 RNA 抽提试剂 Trizol和反转录试剂盒均购自日本TaKaRa生物公司；TLR4一抗购自美国 Cell Signaling 公司；Western blot二抗购自 LI-COR 公司。

1.2方法

1.2.1沙棘多糖的提取与测定 采用水提醇沉法提取沙棘果实多糖组分[11]。沙棘浆果粉采用固体：液比1∶20(w/v)的比例热水提取4次(80℃)，之后乙醇分级沉淀，Sevage法去除蛋白，木瓜蛋白酶消化。SP经Sephadex G150凝胶(Pharmacia)后高效液相色谱法检测其纯度。结果表明，SP由75%糖、14.2%糖醛酸组成。色谱分析显示，多糖是由甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和鼠李糖组成，其摩尔比为：2.02∶1.02∶4.24∶1∶9.22[11]。

1.2.2APAP药物性肝损伤模型的构建 C57BL/6系雄性系小鼠随机分为6组，每组6只，即空白组(Ctrl)、APAP模型组(APAP，350 mg/kg)、N-乙酰半胱氨酸组(NAC，150 mg/kg)、SP低剂量组(APAP/SP100，100 mg/kg)、SP高剂量组(APAP/SP200，200 mg/kg)和SP对照组(SP200，200 mg/kg)，SP连续灌胃30 d，空白组和模型组灌等体积的生理盐水，NAC在造模1 h前腹腔注射，16 h后将小鼠处死，采集血清以及肝脏样本用于后续试验。

1.2.3血清中ALT、AST检测 小鼠血清经过离心稀释处理之后由内蒙古人民医院全自动生化分析仪测其ALT、AST水平。检测结果由内蒙古人民医院检测科提供。

1.2.4肝脏病理学检测 通过事先固定好的肝组织用石蜡切片包埋，并制成5 μm的薄片，采用苏木素-伊红染色法，之后在光学显微镜下观察肝组织整体情况以及细胞的结构形态，炎性浸润情况，细胞核结构完整性等。

1.2.5Western blot检测 肝脏组织按照重量∶体积=1∶9的比例加入组织蛋白抽提液，经破碎后4 000 r/min离心10 min，即得到10%的肝脏匀浆，利用BCA试剂盒方法检测蛋白质含量。检测浓度之后各组取等量蛋白提取液，经SDS-PAGE 泳分离，电转移至PVDF 膜上;取膜并用脱脂奶粉封闭后，与兔抗鼠TLR4的单克隆抗体(1∶1 000)于 4℃ 反应过夜，洗膜后再与羊抗兔 IRDye800CW 二抗(1∶15 000)室温反应 2 h，洗膜后利用 ODYSSEY CLX 检测特异性蛋白条带，采用 Imagine Studio 软件分析。

1.2.6Real-time PCR分析 采用Trizol法提取肝组织中的RNA，上样量为500 ng进行反转录PCR，引物序列见表1,Real-time PCR 计算方法采用 2-ΔΔCT法。

1.3统计学处理 数据间显著性差异通过SPSS邓肯氏多重比较法计算，P<0.01认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1SP对血清中ALT、AST水平的影响 SP采用连续灌胃30 d的方式来评估其安全性。如图1所示，SP对照组(SP200，200 mg/kg)ALT和AST的活性与空白组小鼠的活性没有显著差异，表明SP给药不诱导肝毒性,是安全可用的；与空白组相比，模型组的ALT和AST水平明显提高，SP各剂量组的水平明显降低且呈一定的剂量依赖性，各剂量组与模型组相比差异均具有统计学意义(P<0.01)。

表1Real-timePCR引物序列

Tab.1PrimersequencesofReal-timePCR

PrimernamePrimersequenceIL⁃6antisense5′⁃TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC⁃3′IL⁃6sense5′⁃TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC⁃3′TNF⁃αantisense5′⁃TTGATGGTGGTGCATGAGAG⁃3′TNF⁃αsense5′⁃AAACACAAGATGCTGGGACA⁃3′

2.2SP对APAP诱导的肝损伤的影响 利用石蜡包埋小鼠肝组织并切成薄片，HE染色，在200倍光学显微镜下，观察小鼠肝组织情况。如图2所示在空白组(生理盐水)中，肝细胞形态结构正常，细胞核无损坏；与空白组相比，模型组(APAP，350 mg/kg)能够看到明显的肝细胞核破裂，肝细胞的坏死，炎性细胞浸润以及坏死灶；SP低剂量组(APAP/SP100，100 mg/kg)中仍能看到多个坏死灶；而在SP高剂量组(APAP/SP200，200 mg/kg)以及N-乙酰半胱氨酸组(NAC，150 mg/kg)中显示肝细胞的损坏情况以及炎性细胞浸润，坏死灶等均有所的减轻；SP对照组(SP200，200 mg/kg)中可见细胞状态正常，无损伤产生。说明SP能够通过抑制肝损伤组织中炎症，起到保肝的效果。

2.3SP对肝组织TLR4和p-JNK的影响 如图3所示，与空白组相比，SP对照组表达正常，而模型组TLR4表达量显著提高(P<0.01)；N-乙酰半胱氨酸组、SP剂量组与模型组相比均明显降低(P<0.01)。灰度扫描结果也显示，模型组含量显著提高(P<0.01)，SP各剂量组与模型组相比均明显降低(P<0.01)。说明SP可以显著抑制TLR4的活化(P<0.01)。在图4中，相对于空白对照组，SP对照组表达正常，模型组p-JNK明显升高(P<0.01)，SP各剂量组显著下降(P<0.01)，高剂量组效果最为显著，灰度扫描结果相同，说明SP对p-JNK有抑制作用。

图1 SP对血清ALT和AST水平的影响Fig.1 Effects of SP on serum levels of ALT and ASTNote:**.P<0.01.

图2 SP对肝组织的影响(HE 染色，×200)Fig.2 Effects of SP on liver tissues(HE staining,×200)

2.4SP对炎性细胞因子的影响 如图5所示，相比空白对照组，SP对照组表达正常，模型组中的TNF-α和IL-6表达量均明显升高(P<0.01)，N-乙酰半胱氨酸组和SP高剂量组中TNF-α和IL-6的表达量显著降低(P<0.01)，表明高剂量SP对促炎性因子TNF-α和IL-6有抑制作用(P<0.01)。

图3 Western blot检测沙棘多糖对TLR4的影响Fig.3 Effects of SP on TLR4 as detected by Western blotNote:**.P<0.01.

图4 Western blot检测沙棘多糖对p-JNK的影响Fig.4 Effects of SP on p-JNK as detected by Western blotNote:**.P<0.01.

图5 Real-time PCR检测沙棘多糖对炎症细胞因子的影响Fig.5 Effects of SP on inflammatory cytokines as detected by Real-time PCRNote:**.P<0.01.

3 讨论

实验前期研究结果表明，SP具有抗炎和抗氧化作用，可以拮抗内毒素性肝损伤以及刺激巨噬细胞的活化与增殖[12,13]。本实验是进一步探究SP对药物性肝损伤的保护作用，采用实验室自提SP作为治疗药物，NAC(临床上拮抗APAP毒性的一种治疗药物)作为阳性对照，研究SP对APAP诱发的药物性肝损伤组织的保护作用机制，发挥保肝作用。在以上结果中显示，SP对照组与空白组相比，其所有指标均处于正常水平，说明SP给药并不引起肝损伤，是安全可靠的；SP剂量组能够有效地降低血清中ALT、AST水平，证实了SP对APAP诱发的药物性肝损伤有保护作用；在HE染色中我们也进一步观察到SP剂量组能够改善肝细胞的损坏、炎性细胞浸润以及坏死灶的程度，发挥了保肝的功效；Western blot检测了TLR4、p-JNK、p-erk、p-p38的表达，其中p-erk与p-p38的SP治疗组与模型组相比，没有显著的降低，因此数据中并未显示。但在SP对TLR4和p-JNK的结果中表明SP剂量组能够显著抑制药物性肝损伤组织中TLR4和p-JNK的表达，说明SP是通过抑制TLR4-p-JNK通路而减轻肝损伤；Real-time PCR结果也显示，SP高剂量(200 mg/kg)下对TNF-α、IL-6的表达具有明显的抑制作用。

综上所述，本研究可以证明SP能通过抑制APAP诱导的小鼠急性肝损伤组织中的TLR4-p-JNK通路，抑制促炎性因子TNF-α、IL-6的产生，发挥抗炎活性，减轻肝损伤程度，保护肝脏免受药物损害，为药物性肝损伤的治疗提供了新途径，也为SP作为治疗APAP诱导的药物性肝损伤的食用保健型药物提供了依据。