肝癌细胞下调IGF-1活性因子对Ras癌基因诱导小鼠肝肿瘤影响分析

刘洪琪，李宪忠

(潍坊学院医院医务部,山东潍坊 261061)

肝癌是一种极为严重的恶性肿瘤，其发病率在同类疾病中高居第5位，病死率极高，据统计其死亡人数年均高达百万，对人们的生命造成了极大威胁，基于此探究肝癌发病机制已经成为医学研究者普遍关注的问题[1-3]。机体免疫系统的破坏是恶性肿瘤产生的直接原因，免疫系统所产生的淋巴细胞能够对肿瘤细胞起到破坏作用，进而抑制其生长扩散，最终发挥免疫作用。胰岛素生长因子(insulin-like growth factors，IGF-1)是一种与肿瘤有紧密联系的具备较多生理功能的细胞因子，它来源于机体较多器官和组织细胞，其中肝脏所分泌的IGF-1占绝大部分[4-7]。有研究证实，IGF-1能够对B淋巴细胞的增殖和抗体的产生起到促进作用，但机制尚不明确； 在肝癌患者发病过程中，临床表现的淋巴细胞水平降低及功能减弱等情况表明，IGF-1的分泌与肝癌的发生也有一定联系[8]。本实验通过研究肝癌细胞下调活性因子对Ras癌基因诱导小鼠肝肿瘤的影响，检测小鼠IGF-1、外周血B淋巴细胞、活性B淋巴细胞及其他因子的水平，分析对肿瘤发生、发展的影响及机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取本院实验中心3、5、9月龄Ras癌基因诱导雄性小鼠各10只，同时选取非转基因3、5、9月龄雄性小鼠各10只，所选小鼠体质量平均(28.52±3.61)g，饲养环境：室温21～27 ℃；温差低于4 ℃；空气湿度35%～65%；每12小时变更昼夜状态，每小时空气更换不低于10次；保持空气流通，环境干净，氨浓度不高于14 mg/m3；噪声不高于60分贝。实验动物许可证SYXK(京)2015-0012。

1.2药物及仪器 FIVP3000型流式细胞仪，杭州思创医疗器械公司；SVP生物化学分析仪，广州博泰医疗器械公司；E-5200电泳仪，石家庄华康医疗器械公司；5%胎牛血清(批号:12091621)，上海恒瑞医药股份有限公司；免疫发光试剂，批号:12090151，西安立邦制药有限公司；蛋白测定试剂盒(批号:20040772)，江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.3方法

1.3.1样本采集 解剖Ras转基因鼠取其肝肿瘤组织及周围组织，解剖非转基因鼠，取其肝组织作为对照组，将所取组织制作成1 cm3组织块，置于低温、液氮环境下封存，提取两组样品总RNA和蛋白质，以便后期测量不同因子所用。

1.3.2方法及指标 蛋白质印迹法对其细胞外信号调节激酶(ERK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)蛋白表达进行检测；检测时针对不同组织采用多样本、多时间段测量，计算其平均水平。蛋白质印迹法：选取制作好的样品置于冰盒上，并调整不同样品盒浓度至相同，沸水处理4～6 min，对样品加孔处理并注入所用试剂，置于电泳槽中，通电电泳2～3 min，等待蛋白转膜完成后，抽取聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，蛋白一面朝上置于5%脱脂奶粉中，浸润均匀后取出，从一侧边缘添加入缓冲液3 mL，匀速摇动至均匀，再使用辣根过氧化物(HRP)标记山羊抗兔二抗，室温培养，冲洗后使用发光试剂盒显影，在图像处理软件辅助下，对显影条带光密度进行分析，统计蛋白表达数据。

PCR对IGF-1、GHR、IGFBP3的mRNA表达水平进行检测；检测时针对不同组织采用多样本、多时间段测量，计算其平均水平。引物序列IGFBP3(F:CGA GTG ACC GAT TCC AAG TT)；GHR(F:ATC CCA CAT CAC TGG CAA AC)；IGF-1(F:TGC CCA AGA CTC AGA AGT CC)；PCR反应条件：94 ℃，5 min，循环1次；94～72 ℃，1 min，循环40次。酶联免疫法对小鼠血清IGF-1水平进行检测。酶联免疫法：在酶标板上加入样品提取液，密封后常温培养0.5 h，稀释、洗涤后进行加酶处理，再加入显色剂避光显色8～10 min。加入终止液15 min后进行测定，空白处为0，在450 nm波长下依次依序测量吸光度值(A值)。以横坐标：标准物浓度，纵坐标：A值绘制标准曲线，结合样品浓度及稀释倍数，通过计算得出样品实际浓度。

检测Ras癌基因诱导小鼠及非转基因小鼠外周血中B淋巴细胞、活性B淋巴细胞水平。流式检测：选取小鼠白细胞悬液平均置于4支离心管做离心处理，时间3～4 min，倒出上清浑浊液体，在离心管中加入B淋巴细胞、活化B淋巴细胞检测试剂，混合均匀后4 ℃下避光培育0.5 h，用缓冲液洗涤细胞，滴入5%胎牛血清磷酸盐缓冲液重悬细胞，过滤处理后置于流式细胞仪检测分析。

2 结 果

2.1不同组织及对照组ERK、PI3K、AKT蛋白平均表达水平比较 Ras癌基因诱导小鼠肿瘤组织ERK、PI3K、AKT蛋白平均表达水平与肿瘤周围组织比较，差异有统计学意义(P<0.05)；Ras癌基因诱导小鼠肿瘤组织ERK、PI3K、AKT蛋白表达水平与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 ERK、PI3K、AKT蛋白平均表达水平比较

a:P<0.05,与肿瘤组织比较

2.2不同组织及对照组IGF-1、GHR、IGFBP3的mRNA平均表达水平比较 Ras癌基因诱导小鼠肿瘤组织IGF-1、GHR、IGFBP3的mRNA表达水平与肿瘤周围组织比较，差异有统计学意义(P<0.05)；Ras癌基因诱导小鼠肿瘤组织IGF-1、GHR、IGFBP3的mRNA表达水平与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 IGF-1、GHR、IGFBP3的mRNA平均表达水平比较

a:P<0.05,与肿瘤组织比较

2.3不同月龄小鼠血清IGF-1水平比较 3月龄Ras癌基因诱导小鼠血清IGF-1水平与非转基因小鼠比较无明显差异(P>0.05)；5、9月龄Ras癌基因诱导小鼠血清IGF-1水平均低于非转基因小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3不同月龄小鼠血清IGF-1水平比较

表4 小鼠B淋巴细胞、活性B淋巴细胞占淋巴细胞比例比较

2.4不同月龄小鼠B淋巴细胞、活性B淋巴细胞占淋巴细胞比例比较 3、5、9月龄Ras癌基因诱导小鼠B淋巴细胞比例均低于非转基因小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)；3、5月龄Ras癌基因诱导小鼠活性B淋巴细胞比例与非转基因小鼠比较无明显差异(P>0.05)；9月龄Ras癌基因诱导小鼠活性B淋巴细胞比例低于非转基因小鼠，差异有统计学意义(P<0.05),见表4。

3 讨 论

IGF-1是机体内生长激素刺激所产生的一种激素，它不仅在细胞分化与增殖、机体生长发育中有着重要作用，与肿瘤的发生也存在着紧密联系，其基因所包含的外显子能够转录、翻译相应产物[9-11]。人体肾脏、脑、脾胃等组织都能够产生并分泌IGF-1因子，但85%以上的因子由肝脏合成分泌。

本研究表明，肝癌组织中GHR mRNA、IGF-1 mRNA平均表达水平较肝癌周围组织明显降低，表明GHR、IGF-1水平下降。由于IGF-1是GHR表达的靶基因，加上机体IGF1是肝脏细胞在生长激素刺激下表达分泌的，可以推断Ras癌基因诱导肝肿瘤发生是GHR、IGF-1水平下降所导致，这与文献[12-13]的研究结果一致。肝癌组织中IGFBP3 mRNA平均表达水平升高，说明IGF-1在受到GHR调控的同时也受到IGFBP3的调节，IGFBP3在机体蛋白类物质中占85%左右，它能够抑制IGF-1与相应受体的结合，因此IGFBP3能够抑制IGF-1的产生。Ras癌基因诱导小鼠肿瘤组织ERK、PI3K、AKT蛋白平均表达水平较其他组织明显升高，这就表明在肝肿瘤细胞中Ras的活化刺激了ERK通路，由于ERK对IGFBP3的表达有抑制作用，而IGFBP3能够抑制IGF-1的产生，因此ERK通路的活化最终对IGF-1的表达起到抑制作用[14]。IGF-1在机体造血过程中发挥着重要作用，它通过对骨骼生长及骨密度的调控作用，最终调节造血细胞量，并直接影响多种造血细胞的发育。本研究结果显示，3、5、9月龄Ras癌基因小鼠B淋巴细胞比例均低于非转基因小鼠，可能是因为IGF-1能够促进原B淋巴细胞分化最终成为前B淋巴细胞；同时IGF-1也是B淋巴细胞增殖的促进剂，IGF-1能够促进骨髓、脾脏B淋巴细胞的增殖。有研究发现IGF-1对骨髓中B淋巴细胞发展有重要作用，且IGFBP3能够抑制B淋巴细胞的增殖。体液中，IGF-1能够增强B淋巴细胞产生抗体，由此可见，IGF-1在机体免疫原力形成方面有着重要作用，IGF-1 表达的降低致使其分泌量减少，同时也减弱了对B淋巴细胞的增殖及活性的促进，进而导致了肿瘤的发生、发展[15]。

综上所述，IGF-1的表达的抑制，降低了PI3K、AKT、GHR的表达，提高了ERK、IGFBP3的表达，进而导致Ras癌基因通路的活化。