梅毒螺旋体特异性抗体检测方法在血清学诊断中的应用评估

庄亦晖，龚 燕，许晓峰，卢仁泉，高 翔，郭 林

（复旦大学附属肿瘤医院检验科 复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032）

梅毒是一种严重危害人体健康的性传播疾病，现已成为全世界显著的公共卫生问题之一[1]，其病原体为梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）。目前，TP尚不能在体外培养，因此测定血清中的TP抗体就成为临床诊断梅毒感染的主要途径。血清学诊断方法主要分为2类：第1类为非TP抗原血清试验，检测的是针对类脂抗原的抗体，即反应素，常用方法有性病研究实验室试验、快速血浆反应素环状卡片（rapid plasma reagin，RPR）试验、甲苯胺红不加热血清试验（tolulized red unheated serum test，TRUST）等；第2类为TP抗原血清试验，检测的是TP的特异性抗体，主要有梅毒螺旋体血凝试验、梅毒螺旋体明胶凝集试验（Treponema pallidum particle assay，TPPA）、荧光密螺旋体抗体吸附试验、酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、免疫层析法、化学发光法（chemiluminescence immunoassay， CLIA）及免疫印迹法等。如果第1类试验有反应性，需经第2类试验证实，以排除假阳性。本研究拟评估免疫层析法和化学发光微粒子免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）在检测TP特异性抗体中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 样本来源

350份血清样本均来自复旦大学附属肿瘤医院门诊及住院术前检查患者，其中男性样本194例、女性样本156例，年龄45~67岁。

1.2 仪器与试剂

TPPA试剂购自日本伯乐富士瑞必欧株式会社。Determine Syphilis TP抗体胶体硒法试剂（免疫层析法）购自美国雅培公司。ARCHITECT Syphilis TP试剂（CMIA）购自美国雅培公司，检测仪器为ARCHITECT i2000SR全自动化学发光免疫分析仪（美国雅培公司）。免疫印迹法试剂购自欧蒙医学诊断（中国）有限公司。TRUST试剂购自上海荣盛生物有限公司。

1.3 方法

350份样本首先采用TPPA和TRUST测定，然后采用免疫层析法和CMIA平行检测，2种方法检测结果不一致的样本再用免疫印迹法复核。所有操作和结果判读均严格参照试剂和仪器说明书。免疫层析法以检测试纸条上质控线和检测线均出现为样本有反应性。CMIA以相对发光值（relative light unit，RLU）与校准品临界值的比值（S/CO）报告，S/CO≥1.0为样本有反应性。根据TPPA检测结果分组：第1组125份样本，为TPPA有反应性；第2组25份样本，为TPPA 1∶80弱反应性；第3组200份样本，为TPPA阴性。第1组和第2组合计150份样本用于方法敏感性评价。第3组200份样本用于方法特异性评价。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0版进行统计分析。数据以率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

第1组和第2组150份样本中，免疫层析法检出有反应性样本145份，5份未检出（样本号为1～5号），敏感性为96.7%（145/150）；CMIA检出有反应性样本150份，敏感性为100.0%（150/150），2种方法的敏感性差异无统计学意义（χ2=3.3，P＞0.05）。第3组200份样本中，免疫层析法检出弱反应性样本8份（样本号为6～13号），CMIA检出有反应性样本16份（样本号为6、7、10、11、13～24号）。免疫层析法与TPPA有13份样本的检测结果不一致，2种方法的一致率为96.3%（337/350）；CMIA与TPPA有16份样本的检测结果不一致，2种方法的一致率为95.4%（334/350）。见表1。

对24份检测结果不一致的样本采用免疫印迹法进行复核。第1组和第2组中免疫层析法未检出的5份样本（样本号为1～5号）免疫印迹法结果均为有反应性，其中1、3、5号样本在TpN47条带处显示较淡条带。在第3组免疫层析法有反应性的8份样本（样本号为6～13号）中，7号和10号样本的免疫印迹法结果为有反应性；在CMIA有反应性的16份样本（样本号为6、7、10、11、13～24号）中，7、10、17、21和23号样本的免疫印迹法结果为有反应性，但这5份样本缺乏临床信息来支持疾病的进一步明确诊断，为不确定结果，需要今后跟踪随访，因此这5份暂不作为阴性样本；此外，6、13、14、16、18和20号样本的免疫印迹法结果为临界，作为阴性结果处理。因此，最终校正后的方法特异性如下：免疫层析法的特异性为98.5%（192/195），CMIA的特异性为94.4%（184/195），2种方法的特异性差异无统计学意义（χ2=3.6，P＞0.05）。见表2、表3。

表1 免疫层析法和CMIA的检测结果

表2 24份检测结果不一致样本的免疫印迹法结果

续表2

表3 24份检测结果不一致样本的免疫印迹法结果汇总

3 讨论

在过去30多年中，TP细胞壁脂蛋白的分离与提纯以及基因重组技术的出现，使TP的实验室检测技术飞速发展，其中最常见的4个用于TP特异性抗体检测的特异性多肽是TpN15、TpN17、TpN45和TpN47[2]。本研究评估的免疫层析法和CMIA包被抗原中均包含TpN47。TpN47具有免疫原性强、诱导早期体液免疫及其抗体存在于未治疗梅毒的各个阶段等特点[3]。

本研究结果显示免疫层析法的敏感性和特异性分别为96.7%、98.5%；CMIA的敏感性和特异性分别为100.0%、94.4%，2种方法的敏感性和特异性差异均无统计学意义（P＞0.05），可以满足不同实验室的检测需求。

在敏感性方面，CMIA检测出了所有TPPA有反应性和1∶80弱反应性的样本，显示出很高的敏感性，与文献报道[4-5]一致。这可能与其试剂中联合包被3种重组抗原（TpN15、TpN17、TpN47）有关，与免疫层析法试剂仅包被TpN47抗原相比，更广的抗原谱提升了对TP特异性抗体的检测能力。免疫层析法未检出的5份TPPA有反应性的样本，免疫印迹法均出现了2条以上的特异性条带，结果为有反应性，其中有3份样本的TpN47条带较淡，因此样本中相应抗体的浓度较低。由此推测这5份样本均有可能是因为抗体浓度过低、降低了抗原抗体反应的强度而导致免疫层析法出现假阴性结果。

在特异性方面，CMIA在梅毒低危人群中有一定比例的假阳性。这种现象最先由美国疾病预防控制中心报道：在梅毒低危人群中，如ELISA或CLIA检测TP特异性抗体有反应性，但RPR试验或TRUST检测无反应性且TPPA也无反应性，则可排除TP感染[6-7]。出现这种假阳性现象的原因至今不甚明了，有可能是体内共生螺旋体产生的交叉抗体[8]。本研究结果显示，在去除免疫印迹法结果为临界的5份样本后，在其他195份TPPA无反应性样本中，CMIA有11份样本（5.6%）可能为假阳性结果，这11份样本免疫印迹法结果为6份可疑、5份阴性；免疫层析法有4份样本为弱反应性，其中3份样本的免疫印迹法结果出现单条TpN47条带，确切原因未知。BAKER-ZANDER等[9]的研究结果显示，正常人血清中可存在少量与TpN47发生反应的免疫球蛋白。这可能是免疫层析法出现弱反应性的原因之一。

联合国开发规划署、世界银行、世界卫生组织的性传播疾病诊断规划组对6种检测TP特异性抗体的快速诊断产品的联合评估结果显示，免疫层析法的敏感性和特异性分别为97.2%、94.1%[10]，与本研究结果相似。因免疫层析法具有操作简便、结果直观、可采用全血进行检测的特点，所以被世界卫生组织推荐至疾病高发地区或发展中国家的基层诊所或实验室进行进一步评估。由此可见，在梅毒高发人群中可以先用免疫层析法进行筛查，并结合TRUST或RPR试验确定患者是否为新发感染。SIEDNER等[11]采用免疫层析法检测了梅毒高风险患者的全血样本，结果显示敏感性和特异性均为100% 。

筛查TP感染以往最普遍的方法是TRUST或RPR试验，考虑到其生物假阳性现象，需用TPPA加以确认，而基层医疗机构中往往因样本量少以及试剂、仪器、人员、技术等因素而不开展TPPA，因此更趋于选择对操作者技术要求不高的免疫层析法。在大型综合性医院、专科医院以及采供血医疗机构中，日益增加的样本量使得以手工操作为主的TPPA面临严峻挑战，而可以实现自动化操作的ELISA和CLIA能满足实验室高通量检测的需求，因此TP的实验室筛查逐渐由传统流程转向反向流程[12]。

综上所述，免疫层析法具有操作简便、无需额外仪器，获取结果时间短的优点，适用于基层医疗机构和边远地区的产前筛查。CMIA具有高通量、数据易于保存等诸多优点，在梅毒反流程筛查方案中可作为一线筛查试验，适用于样本量大的大型实验室。总之，CMIA、免疫层析法具有很好的敏感性和特异性，且与TPPA具有较好的一致性，可用于临床检测。