白三叶耐酸铝种质资源筛选研究

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(1. 湖南农业大学农学院， 湖南 长沙 410128； 2. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所， 湖北 武汉430064)

白三叶(Trifoliumrepens)是豆科三叶草属多年生优质牧草，在我国引进和栽培历史较长，是南方重要的栽培牧草[1]，适宜生长于pH值5.5～6.5土壤，酸性土壤易遭受铝毒害的影响[2]。白三叶较罗顿豆(Lotononisbainesii)、圆叶决明(Chamaecristarotundifolia)、大翼豆(Macroptiliumatropurpureum)等南方暖季型常见豆科牧草耐酸铝性差[2]，但不同品种之间存在差异。且白三叶耐酸铝特性属隐性遗传，酸铝敏感特性更容易通过杂交遗传给下一代[3]。因此白三叶种质资源的耐酸铝性评价对于育种材料选择尤为重要。

Voigt等[4]于1994年发明一种在琼脂上覆盖一层薄的酸铝毒土进行生根的方法(Soil-on-Agar Method)用于白三叶酸铝耐性评价，在该基质上生根快的白三叶较生根慢的白三叶更耐酸铝，而且该方法也可适用于其他小种子作物。国外对白三叶耐酸铝鉴定主要采用苗期实验室鉴定，以根系生长情况作为主要鉴定指标[3-6]。国内最早进行耐酸铝鉴定的作物是大麦(Hordeumvulgare)[7]，之后大豆(Glycinemax)[8]、圭亚那柱花草(Stylosanthesguianensis)[9]、小麦(Triticumaestivum)[10]、狼尾草(Pennisetumalopecuroides)[11]、鸭茅(Dactylisglomerata)[12]、玉米(Zeamays)[13]、芝麻(Sesamumindicum)[14]、油菜(Brassicanapus)[15]等多个科属的植物陆续进行了耐酸铝性的筛选；但针对白三叶耐酸铝性的报道较少。作为我国南方当家豆科牧草，开展白三叶耐酸铝种质资源评价研究，对充分利用南方酸性红壤区荒山荒地发展人工草地具有十分重要的意义。本试验对来源于俄罗斯的57份种质资源和9份国内外育成品种进行萌发期酸铝耐性综合评价，旨在筛选耐酸铝性强的材料，为白三叶种质资源耐酸铝特性研究奠定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

66份白三叶种子材料由湖北省农科院畜牧兽医研究所提供，57份来源于俄罗斯，9份是国内外育成品种(表1)。

表1 66份白三叶种质资源基本信息Table 1 The basic information of 66 white clover resources

1.2 试验方法

选取大小均匀一致、饱满、无病虫害的种子，用50%多菌灵可湿性粉剂500倍液浸泡种子20 min，蒸馏水洗净待用。以6H2O·AlCl3配制Al3+浓度2 mmol·L-1，pH 4.5的溶液来模拟酸铝胁迫条件，对照组(CK)为去离子水。采用发芽盒滤纸法进行发芽试验，每处理4次重复，每重复50粒种子。每发芽盒分别加入15 ml相应处理溶液，于人工气候箱进行恒温培养(20℃，16 h光照/ 8 h黑暗)，试验过程中不再加入任何溶液，第10 d结束试验。

1.3 观测指标

每隔24 h记录种子发芽数(以胚根或胚芽突破种皮长于种子长度为发芽标准)，并计算种子发芽势(试验第4 d数据)、发芽率(试验第10 d数据)、发芽指数[11]和活力指数(发芽指数 × 根长)。

第10 d每处理随机选取10株幼苗，清水洗净后用LA-S系列植物根系分析系统软件(杭州万深检测科技有限公司)扫描分析幼苗胚根长(mm)、胚长(mm)、胚根长/苗长、胚根表面积(mm2)，胚根体积(mm3)，胚根平均直径(mm)等性状指标。

1.4 数据分析

试验数据均使用Excel 2010进行整理计算，用DPS 7.05和SPSS 22进行数据处理与分析。

为减少材料间指标性状固有差异，试验各指标值均使用相对值。指标相对值(%)= 指标胁迫处理值 / 指标对照处理值 × 100。

以相关性分析和因子主成分分析方法进行耐酸铝评价指标筛选；用加权隶属函数法(以变异系数赋予权重)计算综合隶属函数值(D值)对参试材料的耐酸铝强弱排序；用系统聚类法对66份材料进行耐酸铝性强弱聚类。

2 结果与分析

2.1 酸铝胁迫对白三叶种子萌发与幼苗生长的影响

66份白三叶材料萌发期各项指标统计数据(表2)可知：与对照组相比，酸铝胁迫组参试材料的各项指标均值变化除胚长和胚根平均直径为正值外，其余变化值都为负值。白三叶的活力指数、胚根长、胚根长/苗长和胚根表面积等受抑制作用明显，变异系数变化值均在14%以上。

表2 酸铝胁迫下66份白三叶材料10项观测指标的变化情况Table 2 Variation of 10 indexes value in 66 white clover materials under acid-aluminum stress

2.2 观测指标相关性分析

对10项指标相对值进行两两相关性分析(表3)：白三叶的萌发和根系生长两类指标间分别存在极显著或显著相关性(P<0.01或P<0.05)；其中，相对发芽势、相对发芽率和相对发芽指数，两两间存在极显著相关性(P<0.01)；相对活力指数与其它胚根指标均存在极显著相关性(P<0.01)。

表3 酸铝胁迫下66份白三叶材料各指标间相关系数Table 3 Pearson correlation coefficients of indexes in 66 materials under acid-aluminum stress

注：**表示极显著相关性(P<0.01)，*表示显著相关性(P<0.05)

Note: **indicates significant at the 0.01 level. *indicates significant at the 0.05 level

2.3 耐酸铝评价指标筛选

对10项指标进行因子主成分分析(表4)发现：前三个主成分的累积贡献率达到83.182 %，且特征值均大于1。结合因子载荷矩阵(表5)，确定第一主成分为胚根生长因子，对应特征向量中载荷较大的5个指标是相对活力指数、相对胚根长、相对胚根表面积、相对胚根长/苗长和相对胚根体积；第二主成分为萌发特性因子，对应特征向量中载荷较大的3个指标为相对发芽势、相对发芽率和相对发芽指数；第三主成分反映植株形态特征，定名为株型因子，特征向量载荷较大的2个指标为相对胚根平均直径和相对苗长。

综合指标相关性分析和因子主成分分析结果，在第一主成分胚根生长因子中选择与其他指标存在极显著相关性且特征值最大的指标是相对活力指数，第二主成分萌发特性因子中选择与其他根系指标存在极显著相关性且特征值最大的指标是相对发芽势，第三主成分株型因子中选择与其他指标极显著相关且特征值最大的指标是相对胚根平均直径。以上3项指标作为白三叶萌发期耐酸铝性的评价指标，用于对66份白三叶材料进行耐酸铝性综合隶属函数值的计算。

表4 三个主成分的特征值以及贡献率Table 4 Special values and contributions of 3 principal components

表5 各因子载荷矩阵Table 5 Loading matrix of each component

2.4 66份白三叶材料萌发期耐酸铝综合评价

因筛选出的3项评价指标均为正向指标，所以用正向隶属函数公式计算各指标的隶属函数值。根据变异系数赋权公式计算出3项指标的权重值，用综合隶属函数公式计算66份白三叶材料的耐酸铝综合隶属函数值(D值)。表6中综合隶属函数值结果可看出：66份白三叶材料的耐酸铝能力存在明显差异，排在前三位的编号为66号、17号、8号的耐酸铝综合隶属函数值分别为0.890、0.745、0.675，表明这些材料在66份材料中的耐酸铝性较强；排在最后两位隶属函数值分别是0.128(1号)和0.106(39号)，表明这些材料耐酸铝能力弱。

表6 66份白三叶材料耐酸铝隶属函数值Table 6 Subordinate function value of 66 white clover materials’ acid-aluminum tolerance

续表6

2.5 耐酸铝性能聚类

将66份白三叶材料的耐酸铝综合隶属函数值用欧氏距离平均连锁法进行聚类分析(图1)，在欧氏距离15处将参试材料分为3个类群：第1类群包括编号为66、17、8、14、21、57号，占所有白三叶材料的9%，该类群耐酸铝综合隶属函数值高，表明耐酸铝能力较强。第2类群包括编号为7、30、22、52号等58个种质材料，占所有材料的88%，该类群耐酸铝综合隶属函数值在66份材料中排名居中，表明这些材料的耐酸铝能力居中。第3类群包括编号为39号和1号，占所有白三叶材料的3%，该类群的耐酸铝综合隶属函数值最低，表明这两个材料耐酸铝性最差。由图2可知，3类不同耐酸铝级别的代表性材料在植株根系生长状况差异明显，耐酸铝性强的材料植株胚根生长更健康，而酸铝胁迫敏感材料则表现出明显的根部损伤。

图1 66份白三叶材料耐酸铝性聚类Fig.1 Dendrogram on acid-aluminum tolerance of 66 white clover materials

图2 不同耐酸铝水平代表材料的植株形态对比Fig.2 Comparison of representative materials’ appearance with different acid-aluminum tolerance

3 讨论

3.1 耐酸铝筛选指标的确定

随着氮肥的大量施用、酸雨、不良耕作方式等现象的加剧，我国的土壤酸性问题愈加严重，而铝毒害是酸性土壤的突出问题，筛选耐酸铝毒害的作物品种是解决酸性土壤地区生产最为便捷的途径[16]。铝对植物的毒害首先表现在抑制植物根系的生长，进而影响养分和水分的吸收，因而根系生长相关的指标往往是作物铝毒耐性筛选时主要的评价指标[17]。林咸永等[10]和李学文等[18]认为相对根长或根相对伸长率是小麦或豌豆耐酸铝性较为理想的筛选指标。除应用单一根系指标外，还有些使用根系及地上部的多个指标作为酸铝的综合评价指标，如应小芳等[8]研究发现大豆相对根系干重、相对地上部干重、相对株高、相对叶面积与所有农艺、生理指标进行的秩和比排序获得的综合评价系数呈极显著相关，可作为大豆耐铝毒基因型筛选的有效指标。唐新莲等[13]以根尖相对伸长率、根尖胼胝质和铝含量和根尖染色作为玉米耐铝性的综合筛选指标；孙建等[14]以相对成苗率，相对芽长，相对根长，相对苗鲜重作为芝麻的评价指标；褚晓晴等[19]利用相对根系干重、相对地上部分干重、相对全株干重对假俭草的杂交后代的耐酸铝性评价。本试验通过主成分分析和相关性分析确定相对活力指数、相对发芽势和相对胚根平均直径作为白三叶苗期耐酸铝评价指标。由此可见，不同作物对酸铝胁迫反应有所区别，不同品种间农艺形状或生理指标的变异系数各不一致，但总体来看，根系性状是重要的参数，本试验中首次提出相对平均直径作为白三叶的筛选指标。

3.2 耐酸铝筛选统计方法的选择

植物的抗逆性是多种因素相互作用构成的较为复杂的综合性状，多种因素或性状在反映植物抗逆性本质时存在一定的相关关系和主次关系。因此，对植物抗逆性的评价应有系统科学的评价方法。模糊数学中隶属函数法或者欧氏距离聚类分析法经常被用于评价植物抗逆性[11，14]，它能对多项观测指标进行综合评价，可有效避免单一指标评价的片面性。但它会忽略多项观测指标间存在的相关关系和主次关系。在统计学分析中，指标相关性分析和主成分分析能客观地分析指标间相关关系和主次关系；变异系数赋权法能较好地区分指标重要性差异。因此，本研究结合以上方法，先筛选抗逆评价指标，然后对指标进行赋权，最后计算加权隶属函数值对植物抗逆性进行综合评价。这种通过多指标、去重复、算权重的方法，既能全面反映植物抗逆性信息，又能客观区分指标重要性差异，是一套适用于评价植物抗逆性的科学系统的分析方法，可广泛应用于植物抗逆性鉴定和筛选的研究工作。

4 结论

酸铝胁迫对白三叶种子萌发和幼苗生长造成不利影响，幼苗根的伸长会受到抑制，根长与苗长比值、胚根表面积、胚根体积等根系指标受抑制作用明显，根直径增加，但不同材料间存在显著差异，耐酸铝性强的材料较不耐酸铝材料受抑制影响小。

根据指标相关性分析和因子主成分分析筛选出相对活力指数、相对发芽势和相对胚根平均直径等3项酸铝胁迫耐性评价指标。

耐酸铝性较强的材料有：‘海发’， ‘ZXY06P-1927’，‘ZXY06P-1768’，’ZXY06P-1879’，‘ZXY06P-2029’，‘ZXY06P-2659’；其中‘海发’在我国南方已有较大范围的种植区域，其余5个材料是来源于俄罗斯的种质资源，未来可对这些材料进一步研究，为耐酸铝白三叶遗传育种和种植推广提供科学支持。