荧光染色、PAS染色和美蓝染色在马拉色菌毛囊炎诊断中的比较

钟白玉，徐 艳，邓向芬，张 静，高 星，宋志强，翟志芳

马拉色菌为马拉色菌毛囊炎的病原菌，在临床检测中一般用KOH涂片直接镜检常因圆形均质的暗绿色反光颗粒的脂肪滴与马拉色菌菌体极其相似而混淆，难以获得满意效果。本研究对100份马拉色菌毛囊炎患者临床标本分别采取真菌荧光染色、过碘酸雪夫染色（PAS）和美蓝染色进行染色效果及阳性率比较，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 病例来源

收集2017年6月～8月皮肤科门诊拟诊为马拉色菌毛囊炎患者100例。患者年龄13～45岁，男72例，女28例。病例纳入标准：拟诊为马拉色菌毛囊炎；皮损多发；无明显脓疱、糜烂渗出等；同意进行该项检查者。

1.2 染色液（试剂）

溯康®真菌荧光染色液（南京汉瑞生物科技有限公司生产，重庆林睿康医疗器械有限公司提供，批准文号：苏宁械备20160022号）；PAS染色试剂：按王端礼主编《医学真菌学-实验室检验指南》的配方配制[1]；美蓝染色液：按叶顺章和张木有主编的《性传播疾病实验诊断手册》的配方配制[2]。

1.3 取材及染色方法

主要选择胸背部和面颈部基本一致的红色丘疹进行取材，取其丘疹内容物或皮屑，每例患者取3份标本分别用于3种染色。以75%乙醇消毒皮损表面，用拔毛镊或钝手术刀片刮取病变皮屑或挤出有白色脓头的丘疹内容物，分别涂布于3张洁净的载玻片上备用。分别以荧光显微镜或普通光学显微镜在中低倍镜下寻找视野中的可疑的染色阳性菌体，再以高倍镜证实并记录。

1.3.1 荧光染色法 在涂布标本的载玻片上滴加1滴溯康®真菌荧光染色液，盖上盖玻片使染色液与标本充分结合，轻压盖玻片并吸去盖玻片周边多余染色液，数秒钟后于荧光显微镜下观察和记录。

1.3.2 PAS染色法 已涂布标本载玻片置于95%乙醇中固定1 min，水洗后再将载玻片浸于1%过碘酸溶液中氧化5 min后水洗，把载玻片放于雪夫试剂中染色5 min后水洗，再以偏亚硫酸钠溶液浸泡1 min后，水洗，自然凉干，滴加1滴香柏油置于普通光学显微镜下观察。

1.3.3 美蓝染色法 在涂布标本的载玻片上滴加1滴美蓝染色液染1～2 min水洗，自然凉干，滴加1滴香柏油置于普通光学显微镜下观察。

2 结果

经真菌荧光染色后，可见圆形或葫芦形的酵母孢子呈亮绿色荧光,背景反差较大，图像清晰，皮屑呈浅蓝色,而其他成分（如脂滴、气泡）不着色；②经PAS染色后，高倍镜下可见孢子染成深玫瑰红色，较为清晰，角质细胞呈淡红色；③经美蓝染色后，可见圆形、出芽成葫芦形的紫红色酵母孢子，较为清晰，脂滴、气泡等背景中的杂质不着色，皮屑亦染成深蓝色（图1）。3种染色方法的阳性率比较见表1。

表1 3种染色方法在马拉色菌毛囊炎诊断中的阳性率比较 [例数(%)]

3 讨论

图1 不同染色方法检测马拉色菌镜下所见

马拉色菌为健康人皮肤正常寄生菌群之一，但与马拉色菌毛囊炎、头皮屑过多、脂溢性皮炎、银屑病、痤疮等有关。临床中，常规KOH涂片检测方法对于马拉色菌的检测敏感度并不能很好满足临床要求。笔者对目前应用于临床的真菌荧光染色、PAS染色及美蓝染色3种检测方法进行了比较分析，三者各有其优缺点。首先，真菌荧光染色液可用于人体组织或样本的染色处理，包括皮屑、甲屑、毛发、尿液、体液及阴道分泌物等，在荧光显微镜下定性检测真菌。主要原理是荧光增白剂与组织中可能存在的真菌细胞壁β-多糖结合，如几丁质和纤维素等，在紫外光的激活下，可使真菌显示出荧光。通过250～400 nm滤镜的荧光显微镜下观察，判断真菌的存在，即使仅有少量的菌体，也能迅速捕获，大大节省了检测时间，并提高了阳性率。PAS染色为传统的多糖成分染色法，是利用过碘酸作为氧化剂，将多糖的葡萄糖分子的两个相邻带有羟基的-C-C-键打开，生成醛基再与染色剂结合。雪夫试剂中的碱性品红为一种混合物，经过亚硫酸和二氧化硫的作用，醌式结构的双键被破坏而消失形成无色复红，再经氧化后醛基与无色复红液进行结合呈紫红色，菌体染色成紫红而清晰可见。美蓝作为一种细胞染色剂，其染色方法是利用美蓝染料对组织蛋白、菌体（多糖成分）有异染性，在配制时若加微量10% KOH溶液即成碱性美蓝染色液，染色过程中使皮屑标本充分溶解，以便菌体与染色液较好结合，菌体染色呈深蓝色，而背景仅着淡蓝色，增加了对比度，提高了分辨力。

经比较研究表明，3种染色方法对马拉色菌均具有很高的阳性检出率，且其检测阳性率相接近。但三者相比较，真菌荧光染色法简便快捷，仅需1滴染色液立即压片即可荧光显微镜观察，而且镜下背景反差较大，图像清晰，相比于PAS和美蓝染色法更易于观察，省时省力。但真菌荧光染色法成本相对较高，需要在荧光显微镜下观察，限制了其临床的广泛使用。PAS染色法菌体被染成玫瑰红色，结缔组织染成浅红色，菌体较易于识别，但其操作相对繁锁、费时，且阳性率略低于另外两种方法。相对于前二者而言，美蓝染色法的菌体染成紫红色，易与脂滴、细胞间隙相鉴别，而且该方法操作简便，对于初学者易于常握，适用于临床广泛应用。