IL-23R基因多态性与宁夏地区银屑病易感性的研究

杨兵艳，扈容英，董灵娣，喻 楠，高永龙，寇 乐

银屑病（psoriasis）是一种常见的T淋巴细胞介导的慢性炎症性复发性以遗传为背景的皮肤病[1]。遗传流行病学已证实银屑病具有显著遗传性，许多研究提示白细胞介素（IL）-23R基因多态性与银屑病发病密切相关。目前国内有关IL-23R基因多态性与银屑病的研究主要集中在南方地区及汉族人群，北方地区及不同种族的相关研究资料相对较少。因此，笔者收集101例宁夏地区寻常性银屑病患者和103例正常对照，选择在欧美及中国南方汉族人群中发现的易感位点即IL-23R 基因的5个SNP位点（rs11209032，rs1343151，rs10489629，rs10889677，rs1495965），应用TaqMan探针荧光聚合酶链反应（PCR）技术对其进行基因分型，以进一步探讨宁夏地区人群中IL-23R基因多态性与寻常性银屑病的易感性关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2016年4 月—2017年4月前来我院皮肤科门诊及住院部就诊的宁夏地区寻常性银屑病患者101例，这些患者均被2名副主任医师以上皮肤科医生确诊，均与寻常性银屑病的诊断标准相符[1]。其中男69例，女32例，平均年龄（34.81±16.98）岁。正常对照组103例，其中男61例，女42 例，平均年龄（34.15±16.06）岁。正常对照均来自我院体检中心的健康人或我院健康职工，同时要求对照组中一～三级亲属中未患银屑病。两组间性别（χ2=1.824，P＞0.05）和年龄（t=0.284，P＞0.05）差异均无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 临床资料和全血标本的采集 由经过专门培训的流行病学调查员，采用统一设计的寻常性银屑病调查表，对患者进行问卷调查。所有受试者均为宁夏地区人群，彼此间无血缘关系。向研究对象充分告知本次研究的目的和意义，并签署知情同意书。知情同意书由宁夏医科大学伦理委员会审议批准。用5 ml的EDTA抗凝管采取受试者外周静脉血3～4 ml，存放于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 外周血基因组DNA提取 将血标本解冻后，严格按照天根血液基因组DNA提取试剂盒相应操作步骤对204份样本外周血DNA进行提取，测定每份样本DNA浓度及纯度，并详细记录，符合标准的离心后存放于-20℃冰箱中备用。

1.2.3 SNP位点的选取 登陆NCBI网站的Genebank数据库查询已公布的1号染色体上IL-23R基因的序列，选取5个已知的并且已证实与银屑病易感性相关的SNP位点（rs11209032，rs1343151，rs10489629，rs10889677，rs1495965）。

1.2.4 TaqMan探针荧光PCR进行SNP的基因分型 采用TaqMan SNP基因分型试剂盒(美国ABI公司)对IL-23R基因5个SNP位点（rs11209032，rs1343151，rs10489629，rs10889677，rs1495965）进行基因分型。TaqMan荧光探针由ABI公司设计并合成。按照试剂盒的要求规范操作，配10 µl的PCR体系用罗氏480的实时荧光定量PCR系统进行基因分型。

1.3 统计学方法

依据哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）检验判断样本是否具有群体代表性，将SNP的等位基因及单体型进行关联分析、遗传连锁不平 衡（linkage disequilibrium，LD） 分 析， 应 用Haploview4.2软件[2]进行Hardy-Weinberg平衡检验、LD分析和每个位点在患者组、对照组中等位基因频率和单体型频率差异的卡方检验。在进行数据分析之前，需要对实验数据资料进行整理，分别整理成该软件识别的文件格式类型即.ped文件和.info文件。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验

Position表示IL-23R基因的5个SNP位点（rs11209032，rs1343151，rs10489629，rs10889677，rs1495965）分别在1号染色体上的位置，5个SNP位点在正常对照组中的观察值和期望值吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），表明本研究数据符合统计学要求，样本具有群体代表性（表1）。

2.2 IL-23R基因5个SNP位点与寻常性银屑病关联分析

Haploview4.2软件分析发现，患者组和对照组间IL-23R基因5个SNP位点等位基因频率分布无明显统计学意义（P＞0.05）。患者组和对照组中rs10489629位点的A等位基因频率分别为2.607和2.323，两组间无统计学差异（χ2=0.280，P=0.597）；患者组和对照组中rs1343151位点的C等位基因频率分别为32.667和21.889，两组间无统计学差异（χ2=0.563，P=0.453）；患者组和对照组中rs10889677位点的C等位基因频率分别为2.258和2.121，两组间无统计学差异（χ2=0.086，P=0.769）；患者组和对照组中rs11209032位点的G等位基因频率分别为0.853和0.761，两组间无统计学差异（χ2=0.332，P=0.565）；患者组和对照组中rs149565位点的G等位基因频率分别为0.924和0.873，两组间无统计学差异（χ2=0.082，P=0.774）。故认为IL-23R基因这5个SNP位点与宁夏地区寻常性银屑病遗传易感性无显著相关性（P＞0.05）（表2）。

2.3 LD分析、单体型的构建及其与寻常性银屑病遗传易感性的关系

整理后的实验数据在Haploview4.2软件下运行，可直接显示出IL-23R基因的5个位点中rs11209032和rs1495965这两个位点之间存在LD（D'=0.957，r2=0.821）。r2值越大（r2＞ 0.08），D'越接近 1，越容易出现LD。rs11209032和rs1495965构建的单体型分别为AA、GG、AG、GA（图1）。对这两个位点进行单体型分析发现 （表3），患者组和对照组中单体型AA的频率分别为1.059和1.079，两组间无统计学差异（χ2=0.09，P=0.926）；患者组和对照组中单体型GG的频率分别为0.835和0.716，两组间无统计学差异（χ2=0.596，P=0.440）；患者组和对照组中单体型AG的频率分别为0.026和0.052，两组间无统计学差异（χ2=1.605，P=0.205）；患者和对照组中单体型GA的频率分别为0.006和0.015，两组间无统计学差异（χ2=0.921，P=0.337）；故rs11209032和rs1495965构建的单体型与宁夏地区寻常性银屑病发病风险无显著性差异（P＞0.05）。

注：SNP：单核苷酸多态性：P＞0.05时，基因型频率的总体分布符合Hardy-Weinberg平衡定律

表2 IL-23R基因SNPs位点等位基因与寻常性银屑病的关联分析

图1 IL-23R基因SNPs的LD图

表3 IL-23R基因单倍型与寻常性银屑病的关联分析

3 讨论

银屑病是一种T淋巴细胞异常活化和浸润为主的以红斑鳞屑为基本表现的慢性炎症性皮肤病，银屑病在人群中的发病率为1%～3%。该病与遗传有关，具有遗传异质性和种族差异性。目前普遍认为，银屑病是一种由多基因控制和环境因素共同影响的复杂免疫失衡性皮肤病[1]。

IL-23R（位于1号染色体上，其表达IL-23受体，参与T淋巴细胞分化）和IL-12B（位于5号染色体上，其表达IL-12B）是两大主要的免疫系统基因，均与银屑病发病强相关。T淋巴细胞参与炎症反应，导致银屑病[3]。IL- 23R在记忆T淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞以及树突状细胞均有表达，Jak家族中的Tyk2和Jak2可分别与IL-12Rβ1和 IL-23R结合。IL-23分子与受体结合后激活下游Jaks分子，使受体胞内区的stat3结合位点磷酸化，并使stat3二聚体磷酸化，磷酸化后stats二聚体进入细胞核，从而诱导下游靶基因的转录[4]。已有研究证实，在银屑病皮损可发现stat3蛋白的过表达[5]，也有研究显示IL-23细胞因子存在于银屑病患者外周血中[6]。这些研究均提示IL-23R与银屑病发病相关。

SNP是基因组内由单个核苷酸发生变异引起的DNA碱基排列序列的变化，这种变化影响基因功能，从而使个体增加或减少对疾病的易感性。近年来，IL-23R基因单核苷酸多态性位点与银屑病的相关性已在全基因组关联研究和相关的重复性研究中得到证实。Cargill等[7]在北美白种人群中对1 446例银屑病患者和1 432例正常对照组进行了病例对照研究，研究显示银屑病与SNP rs3212227、rs6887695 易感性具有强相关性，并且这种结果在小样本量的日本人群中得到证实。Capon等[8]在欧洲人群中对IL- 23R基因进行遗传性研究显示，IL- 23R/p40SNPs rs10045431、rs3212227与银屑病具有相关性。李珊珊等[9]研究表明，IL-23R基因SNP的1个位点rs376218与汉族人银屑病的易感性相关。罗权等[10]研究了国内汉族人群银屑病与IL-23R基因的4个SNPs位点（rs1343151，rs1004819，rs10889677，rs1495965）有显著相关性。这些关于IL- 23R基因多态性与银屑病相关性研究为银屑病的遗传学发病机制提供了新的线索。

我国有关IL-23R基因多态性与银屑病的研究主要集中在南方地区及汉族人群，分别对其进行过大样本研究[9-11]。而北方地区及不同种族的相关研究资料相对较少。韩建文等[12]曾对中国北方汉族寻常性银屑病与基因多态性做过关联性研究分析，但IL-23R基因多态性与银屑病的关联分析北方地区少见报道。本实验在宁夏地区人群中通过病例对照研究发现IL-23R基因的rs11209032、rs10489629位点与银屑病易感性不相关，这与之前罗权等[10]的报道是吻合的，同时该学者研究证明IL-23R基因的这5个SNPs位点中有3个SNPs位点（rs1343151、rs10889677、rs1495965）与银屑病具有明显相关性（P＜0.01）。而笔者的研究中并未发现这3个位点与银屑病易感性相关，因此进一步做了LD分析，发现rs11209032和rs1495965位点之间有一定的LD（D'=0.957，r2=0.821），对这2个位点进行单体型分析，但仍未发现差异具有统计学意义（P＞0.05）。

虽然在本实验中并未发现IL-23R基因5个SNPs位点等位基因与寻常性银屑病易感性相关，但相关研究显示IL-23R基因多态性与北美、高加索人以及汉族人银屑病易感性显著相关[7-11]，故并不能认为IL-23R基因与银屑病易感性不相关。在欧美人群中研究发现IL-23R基因的SNPs（rs11209026、rs2201841、rs7530511）等位基因与银屑病发病风险相关[13,14]。然而这种相关性并没有在大样本的汉族人群得到验证[15]。IL-23R 基因的另一个 SNP rs2201841，在汉族人群中的最小等位基因为 A，而在欧美人群是G[6]，这种最小等位基因的不同也是人群差异性的一个反映。由此可见，IL-23R区域的SNP信号在不同的人群中存在异质性。在中国南方人群中发现的阳性位点，可能由于SNP频率的不同，环境因素、生活习惯、饮食习惯的差异，也由于各家研究的设计方法、入选标准不一，以及样本量小，统计方法不一，导致结果不尽一致，从而引起IL-23R基因某些位点与宁夏地区人群银屑病易感性无相关性。因此，在探究IL-23R基因多态性与银屑病的相关性时，严格设计、选择多中心的大样本，检测覆盖更多不同基因区域的SNP是非常必要的。希望这种遗传异质性的揭示，为研究不同地区不同种族银屑病与IL-23R基因多态性提供新的遗传线索。