蟾毒灵通过调控Livin蛋白诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

王 博，邵美丽

西北妇女儿童医院妇产科(西安710061)

主题词 卵巢肿瘤 细胞凋亡 @蟾毒灵 @Livin蛋白

卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，由于其早期的发病症状不明显，难以提前发现和治疗，导致卵巢癌病死率一直处于妇科肿瘤的首位。卵巢癌的病因不明，除了手术治疗外，卵巢癌的患者多采用化疗[1]。化疗虽然能有效减少肿瘤细胞的繁殖和侵袭，但同时给机体带来了严重的副作用及不良反应。另外，中晚期卵巢癌化疗后易复发，且具有耐药性。因此寻找一种高效能，少副作用的药物一直是近年来的研究热点。蟾毒灵是一种蟾蜍科动物耳后腺及背部皮肤腺分泌物提取的中药单体，具有解热镇痛、抗炎、强心等多种活性，同时蟾毒灵在抗癌方面也有着巨大作用。研究表明，蟾毒灵能有效抑制多种癌细胞的增殖，有着很好的抗癌作用[2-3]。然而其对卵巢癌细胞是否同样有抗癌作用尚不完全清楚。本实验以卵巢癌OVCAR-3细胞为实验对象，探究蟾毒灵对OVCAR-3细胞活力和凋亡的影响，并初步探讨其中的分子机制。

材料与方法

1 材 料 ①细胞株：本研究采用人卵巢癌OVCAR-3细胞株，该细胞株由西安交通大学第二附属医院妇产科赠予。②药物和试剂：蟾毒灵购买自美国Sigma公司(货号B0261)，溶解于DMSO中，配置成1 nmol/L，冷冻放置。用含血清的DMEM培养液进行梯度稀释至实验浓度。CCK-8试剂盒用于检测细胞活力，购买自上海源兹生物科技有限公司。细胞培养主要试剂包括DMEM培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(四季青公司)和抗生素(碧云天公司)等。实验中Western blot所用试剂和抗体均购买自CST公司。

2 实验方法 ①细胞培养：人卵巢癌OVCAR-3细胞用高糖DMEM培养基培养，其中加入10%的胎牛血清，100 U/ml青霉素+100 μg/ml链霉素，细胞孵箱的参数设置为37 ℃，二氧化碳浓度为5%。每隔两天换一次液。②CCK-8试剂盒检测细胞生长活力：取干净的96孔板，超净台下将对数期生长的OVCAR-3细胞种植于96孔板中，每孔种植3000个细胞，待细胞贴壁后，分别加入浓度为0、0.1、1、10、100、500 nmol/L的蟾毒灵，每组设置5个复孔。继续作用24、48 h，每孔加入10 μl CCK-8试剂，1 h后用酶标仪进行吸光度检测，波长450 nm。以0 nmol/L作为比照值，通过相应数值计算回归方程，并根据方程求得IC50。③流式细胞技术检测细胞凋亡：取对数生长期的OVCAR-3细胞，种植于6孔板中，每孔细胞数2×105/ml，培养12 h后，加入不同浓度(0、1、10、100 nmol/L)的蟾毒灵，待刺激时间达到24 h收集细胞。按照流式细胞正规操作流程，加入Annexin-V和PI，尼龙网过滤后上机检测细胞凋亡情况。④Western blot法检测蛋白表达：细胞刺激过程与流式检测中相同，之后收集细胞，利用试剂盒进行蛋白提取。定量后，煮沸10 min，加入12% SDS-PAGE凝胶垂直电泳分离系统。电泳结束后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜。5%的BSA稀释一抗，孵育Livin(1∶400)，β-actin(1∶5000)和Caspase-3(1∶400)一抗，4℃过夜。清洗膜多次后，孵育二抗1 h。加入显影试剂后，ECL系统显影成像。使用软件进行灰度分析，β-actin作为内参。

结 果

1 蟾毒灵对OVCAR-3细胞活力的影响 结果显示，蟾毒灵处理OVCAR-3细胞24 h和48 h后能明显降低其细胞活力，并且呈剂量依赖性。10 nmol/L蟾毒灵作用24 h后即可降低OVCAR-3细胞活力，并且随着时间或者剂量的增加，对OVCAR-3细胞活力的抑制能力越明显，与未处理的OVCAR-3细胞相比，100 nmol/L蟾毒灵作用24 h的OVCAR-3细胞活力约为对照组的59%。通过构建回归方程，计算出蟾毒灵作用OVCAR-3细胞24 h和48 h后的IC50为(114.6±4.1)nmol/L和(93.2±3.2) nmol/L(图1)。

A：蟾毒灵刺激24 h后的细胞活力；B：蟾毒灵刺激48 h后的细胞活力

2 流式细胞计数分析蟾毒灵对OVCAR-3细胞凋亡的影响 通过流式分析技术，检测蟾毒灵对OVCAR-3细胞凋亡的影响。结果显示，蟾毒灵能显著增加OVCAR-3细胞的凋亡水平，并且呈剂量依赖效应，10 nmol/L蟾毒灵即可显著增加OVCAR-3的凋亡比例，与对照组相比，1、10、100 nmol/L蟾毒灵引起的细胞凋亡百分比为(7.6±1.1)、(17.3±4.3)、(29.8±7.2)(P<0.05)(图2)。

A：流式细胞结果；B：流式结果分析结果

3 Western blot检测Livin和Caspase-3的蛋白表达情况 通过检测Livin和Caspase-3的蛋白表达情况，结果发现，蟾毒灵能显著增加Caspase-3的剪切，并降低Livin的表达。与对照组相比，1 nmol/L和10 nmol/L即可增加Caspase-3的剪切水平，100 nmol/L蟾毒灵作用24 h后Cleaved Caspase-3的表达水平是对照组的(2.2±0.2)倍(P<0.05)。Livin的Western blot结果显示，100 nmol/L的蟾毒灵能显著降低Livin的表达水平，与对照组相比，降低至对照组的(0.4±0.1)倍(P<0.05)(图3)。

A：凋亡蛋白条带；B：灰度分析分析结果

讨 论

随着近年来医疗水平的不断发展，人民预防意识的不断提高，越来越多的癌症能够早期发现，并得到有效治疗[4]。然而，卵巢癌，尤其是上皮癌，由于其症状非常不典型，并且病因尚不明确，导致目前采取的预防措施均不能有效提高卵巢癌的早期发现，导致发现时卵巢癌多处于中晚期，治疗效果也相对有限，因此卵巢癌的治疗也成为了研究的重点[5]。化疗虽然能有效减少肿瘤细胞的增殖，但是会给病人带来极大的身体负担，并且卵巢癌的高复发性和耐药性，也增加了治疗的风险。

近年来，我国科研工作者通过分析多种传统中药的成分，成功分离出了一些具有显著抗癌作用中药产物，蟾毒灵就是其中一个[6]。蟾毒灵是从传统中药蟾酥中提取出来的，其作用广泛，低剂量的蟾毒灵具有强心，止痛和抗炎的作用，而高剂量的蟾毒灵具有明显的抗癌作用[7-8]。之前的研究显示，蟾毒灵对肝癌，膀胱癌和宫颈癌等都有显著的抑制作用[9-10]。我们的结果显示蟾毒灵能有效抑制人卵巢癌OVCAR-3细胞的细胞活力，该结果提示，蟾毒灵在治疗人卵巢癌中也会发挥明显的抗癌作用。

为明确蟾毒灵抑制人卵巢癌的细胞活力的原因，我们通过流式细胞技术分析了，不同浓度蟾毒灵对OVCAR-3细胞的凋亡影响。结果显示随着剂量的增加，蟾毒灵作用后能明显促进卵巢癌细胞的凋亡水平，结果提示蟾毒灵对OVCAR-3细胞的抑制作用可能是通过促进其凋亡而发挥作用的。暴蕾等[11]在2014年发表的文章中，发现蟾毒灵对卵巢癌SKOV-3细胞的抑制作用也是通过促进凋亡水平，该结论与我们的研究结果相一致。

Livin蛋白，是近年来发现的新的凋亡抑制蛋白，也被称为BIRC7蛋白，其结构上又有一个杆状病毒凋亡抑制蛋重复序列(Baculovirus IAP repeat，BIR)和RING指环结构[12]。一般情况下，Livin在体内表达量很低，但是当在某些肿瘤中，例如肺癌、前列腺癌和卵巢癌，Livin的表达量明显升高[13]。焦伊胜[14]发现Livin在卵巢癌的发生发展中发挥重要作用，调控Livin可能是治疗卵巢癌的靶点之一。为了确证Livin是否参与了蟾毒灵促进卵巢癌的凋亡作用，我们检测了加入蟾毒灵后Livin和Caspase-3的表达情况，结果提示蟾毒灵能够显著抑制OVCAR-3细胞中Livin的表达，并促进Caspase-3的剪切。以上结果提示，蟾毒灵抑制卵巢癌细胞的细胞活力，促进癌细胞的凋亡增加，而这一过程可能受到Livin蛋白的调控。