氧化苦参碱对病毒性心肌炎小鼠巨噬细胞移动抑制因子的影响研究*

豆玉凤，史艳平，李 丹，李小青

西安市儿童医院(西安710003)

主题词 氧化苦参碱 病毒 心肌炎 小鼠 巨噬细胞移动抑制因子

病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是儿科临床较常见的心血管疾病，多由病毒侵袭心肌组织引起的弥漫性或局限性病变，病原以柯萨奇病毒最常见[1]。研究显示近年来病毒性心肌炎发病率有上升趋势，且年龄越小，发病率越高[2]。目前本病的发病机制尚不明确，因而临床尚无特效的治疗措施，多采用对症治疗为主，部分患儿急性期后由于炎症持续存在，发展成慢性心肌炎，出现进行性心脏扩大、心律失常、心功能减退甚至心力衰竭，预后不佳。巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种重要的促炎症因子，通过抑制巨噬细胞的移动促进巨噬细胞在炎症部位浸润和增生，同时分泌多种细胞因子参与炎症的反应。目前已有相关研究表明MIF与病毒性心肌炎的发生发展关系密切。近年来中药治疗病毒性心肌炎报道不断，尤其是中药提取物氧化苦参碱(Oxymatrine，OMT)在心血管系统疾病治疗中的显著疗效[3]。本实验研究MIF在VMC小鼠心肌组织中表达，探讨OMT对VMC保护作用机制，为临床OMT治疗病毒性心肌炎提供理论依据。

材料与方法

1 材 料 病毒：柯萨奇病毒B3型 (CVB3)，Nancy株，在Hela细胞中传代，冻融离心3次后，取上清液分装，-70℃保存备用。

2 动物模型制备 4周龄Balb/c小鼠60只，雌雄各半，体重(15±2)g，随机分为4组:空白组、对照组、高剂量OMT组和低剂量OMT组。正常对照组小鼠腹腔接种0.1 ml病毒培养液，其余3组每只鼠经腹腔接种0.1 ml CVB3的病毒液，连用7 d，第8天开始OMT灌胃。剂量分别为高剂量OMT组0.1 mg/(kg·d)，1次/d；低剂量OMT组0.025 mg/(kg·d)，1次/d，连用10 d。17 d后，留取小鼠心脏组织，沿左室中线切为两半，一半放-70℃冰箱保存，用于提取总RNA，另一半用4%甲醛溶液固定，石蜡包埋作病理学检查。

3 检测方法

3.1 RT-PCR检测MIF mRNA的表达：用Trizol试剂提取总RNA，取1.5μg的总RNA进行逆转录后取5 μl的产物行PCR反应。MIF引物序列: 上游引物:5′-GTGCCAGAGGGGTTTCTCTC-3′，下游引物:5′-CAGCAGCTTGCTGTAGTTGC-3′，扩增产物长度198bp。GAPD H引物序列:上游引物: 5′-ACCACAGTCCTGCATGCCATCAC-3′，下游引物: 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′， 扩增产物长度450 bp。逆转录反应条件：95℃ 3 min，94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1min，35个循环后72℃延伸10 min。反应完毕后取5 μl的PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统扫描条带灰度值并进行分析。

3.2 病理学检查：苏木素-伊红(H-E) 染色，在光镜下观察心肌组织病理变化， 并计算心肌病变积分，即计算每个视野炎性细胞浸润和坏死区域面积与整个视野的面积的比值， 每张切片选取5个高倍视野，无病变计0 分，< 25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分，>75%计4分。

4 统计学方法 结果统计分析采用 SPSS 19.0 统计学软件进行。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，当P<0.05时，表明差异有统计学意义。

结 果

1 MIF mRNA的表达结果 见图1。MIF mRNA表达水平在对照组表达量高于空白组(P<0.05)，表明MIF在病毒性心肌炎小鼠心肌表达升高；在氧化苦参碱干预后MIF mRNA表达量明显降低，高剂量OMT组低于低剂量OMT组(P<0.05)。

M：Marker；1：空白组；2：对照组；3：高剂量OMT组；4： 低剂量OMT组

2 心肌病理学结果 高剂量OMT组、低剂量OMT组小鼠心肌坏死组织面积与总面积比值低于对照组(P<0.05)。高剂量OMT组心肌炎症细胞浸润与总面积比值低于低剂量OMT组(P<0.05)， 见表1。空白组见心肌排列规则，胞浆着色均匀，未见心肌细胞坏死及炎症细胞浸润。对照组可见心肌细胞坏死崩解，胞核和细胞轮廓消失，大量的炎症细胞浸润，间质见较多的胶原纤维。高剂量OMT组及低剂量OMT组病变减轻，尤以高剂量OMT组减轻显著，见表1、图2。

表1 各小鼠心肌病变积分(分)

注：与对照组比较，*P<0.05

讨 论

VMC是由嗜心肌病毒感染心肌细胞引起心脏疾病，其发病机制至今尚未完全明确，多数研究认为病毒可直接损伤心肌细胞，还可诱发自身免疫反应使心肌细胞受损，导致心肌细胞变性、坏死，部分患儿会转为慢性心肌炎，出现心功能不全、顽固性心律失常等危及生命[4]。儿童VMC发病率逐年上升，若不及时有效地治疗，预后差甚至威胁患儿生命。细胞因子在VMC发病、发展过程中起主导作用，对其研究检测可帮助判断病情及预后[5]。

图2 各组小鼠心肌病理学检测结果( HE,×200)

目前VMC治疗也缺乏特异性，临床多采用抗病毒、营养心肌、免疫调节等对症治疗，近年来有研究联合中成药治疗VMC在临床取得不错的治疗效果[6]。MIF在1966年被首次发现，是一种前炎症细胞因子，在免疫炎症反应及抗感染等疾病中起了重要作用，随着对其功能研究的深入，近年来其在心肌炎中的作用也受到广泛关注。MIF通过直接抑制巨噬细胞的移动，导致免疫炎症性损伤，同时能刺激巨噬细胞分泌多种细胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α等，并通过它们介导炎症性损伤[7]。刘佩友等研究发现在病毒性心肌炎小鼠心肌组织中MIF mRNA表达水平升高，预示MIF在VMC发病过程中起重要作用[8]。有研究显示VMC患者血清的MIF水平升高，其血清中磷酸肌酸激酶同工酶也随之升高，阻断MIF的表达能降低心肌病变水平[9]。OMT是豆科槐属植物苦参的主要有效成分，又名苦参素，具有抗病毒、抗炎、抗心律失常、抗纤维化、免疫抑制及抗肿瘤等药理作用[10]。文献报道OMT能减轻转化生长因子TGF-β1诱导的心肌细胞损伤，主要发生在MAPK蛋白翻译后的磷酸化修饰期，对心肌细胞起到保护作用[11]。有研究表明OMT能保护内源性的氧自由基，提高细胞中的一氧化碳，一氧化碳合酶，促使冠脉血管舒张，进而减少心肌酶的释放发挥保护心肌的作用[12]。本课题组前期研究表明OMT可以明显提高VMC小鼠存活率[13]。在本研究中MIF mRNA表达水平在对照组表达量高于空白组，表明MIF在病毒性心肌炎小鼠心肌表达升高。对照组未给予OMT干预治疗，其MIF mRNA表达高于高剂量OMT组及低剂量OMT组，提示OMT可能抑制MIF的表达，减轻MIF介导的心肌损伤和炎症反应，对心肌起到保护作用。VMC小鼠给予高剂量OMT干预治疗后，其MIF mRNA表达较低于低剂量OMT干预治疗后，表明OMT对于VMC的治疗作用与剂量呈正相关。本研究同时证实OMT可以明显改善心肌组织的病理改变，减轻坏死病变和炎症细胞浸润，改善预后，为临床OMT治疗VMC提供理论依据。