CaSR在肾结石形成中表达的动态研究*

申茂磊，王勤章，郑丽英，钱 成，徐 浩，钱 彪△

1.石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科(石河子832000)，2.石河子大学医学院第一附属医院院内感染控制办公室(石河子832000)，3.解放军69235部队(奎屯833200)

主题词 肾结石 受体， 钙敏感 乙二醇 因果律

肾结石是肾盏中的矿物质沉积物，常沉积于肾乳头，是泌尿科的常见病[1-2]，且结石的形成原因难以明确，因此，研究结石形成机制是治疗肾结石的重要突破点。草酸钙是大多数结石的主要成分，高钙尿症，高草酸尿是主要的危险因素[3]。国内外学者研究显示，钙敏感受体(Calcium-sensing receptor，CaSR)可抑制肾小管对钙离子的重吸收，从而导致高钙尿，影响结石的形成[4-5]。推测CaSR表达异常可能与肾结石形成有关，本课题组通过胃内灌注乙二醇和氯化铵诱石剂，连续10周动态检测Wistar雄性大鼠肾脏CaSR的表达情况，初步探讨CaSR在乙二醇形成结石中的作用。

材料与方法

1 实验材料 本研究中使用的所有雄性Wistar大鼠都是购自新疆医科大学实验动物中心，6周龄左右，共60只，大鼠可自由获取饮用水。所有大鼠在光照条件下(12 h光照和黑暗周期)，温度、湿度适宜的条件下适应性饲养1周后，按照随机数字表法将大鼠分成正常对照组(30只)和乙二醇组(30只)。

2 实验方法

2.1 动物模型的建立：60只大鼠随机分为正常对照组(2 ml生理盐水灌胃2周)、乙二醇组(大鼠1%乙二醇饮水和2%氯化铵AC 2 ml灌胃2周)每组30只。标准饲料饲养，饮用自来水。

2.2 病理学检查：水合氯醛麻醉处死实验大鼠，手术切取双侧肾，两侧肾脏各取一部分，用甲醛溶液固定并包埋于石蜡中，HE染色后通过普通光学显微镜下观察肾组织形态学变化及肾小管区有无结石结晶，以判断肾结石模型是否成功建立。按照安瑞华等[6]的判定肾脏结石标准的方法进行统计，0级被判为阴性，Ⅰ～Ⅳ级被判为阳性，若同一只大鼠的双肾都是阳性时，则计为1次，观察10周内两组大鼠的肾结晶情况。

2.3 Western blot检测CaSR表达：取病理鉴定模型成功的另一部分肾脏用于做Western blot检测。①将肾脏组织研磨，放入EP管中；②将蛋白裂解液移置1.5 ml EP管中，在4 ℃；③12 000 g条件下离心15 min，离心后缓慢吸取上清放液，移入到一个干净的离心管中，置于-20℃冰箱中备用；④采用BCA法测定蛋白浓度。制备分离胶和浓缩胶，将样品和Loading Buffer混匀100 ℃煮样约5 min，加样20μl，恒压80 V电泳跑胶；⑤结束后采用湿转法转膜，用TBST进行5 min洗膜，共完成两次，然后封闭1 h；⑥加入稀释后的一抗，在4 ℃环境中，于摇床上慢慢摇动孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min；⑦ECL发光试剂中显色，然后进行显影和定影，利用Quantity one软件分析实验图片。

结 果

1 病理组织学检查 1～2周两组未发现晶体颗粒沉积，第3周以后乙二醇组Wistar雄性大鼠肾小管内发现晶体颗粒沉积，且主要分布于近、远曲小管，晶体颗粒大多呈零星散在分布，少部分晶体互相连接成片状分布。第1～10周，对照组Wistar雄性大鼠肾脏内未见晶体颗粒沉积(图1)。1～10周，乙二醇组Wistar雄性大鼠肾脏晶体颗粒阳性11只(59.1%)，因乙二醇组Wistar雄性大鼠在第3周开始成石，而前二周已处死的Wistar雄性大鼠也存在成石的可能，所以在计算成石率时将前两周已处死的大鼠排除在大鼠总计数之外，对照组均为阴性，乙二醇组Wistar雄性大鼠肾脏晶体颗粒阳性率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1 。

A：第9周乙二醇组 B ：第9周对照组

表1 两组Wistar雄性大鼠肾组织结晶分级[例(%)]

注：乙二醇组与对照组成石率相比，P<0.05

2 肾组织CaSR蛋白Western blot检查结果 由条带灰度值可发现CaSR在乙二醇组中持续表达，1～2周和对照组比较无统计学差异，但是3～10周其灰度值逐渐增加且明显高于对照组；1～10周，CaSR在对照组中虽然持续表达，但其灰度值却未见明显改变(图2)。

A、C分别为第6、第9周对照组，B、D分别为第6、第9周乙二醇组；与第6周对照组相比，aP<0.05; 与第9周对照组相比，bP<0.05

讨 论

泌尿系结石是泌尿外科住院病人中最常见的原因，其中肾结石是最常见的病因之一。肾结石发病率及流行率在世界范围内又增加的趋势，有研究显示可能与感染、激素、骨桥蛋白、性别、年龄、种族密切相关[7-12]，但其形成机制仍不明确，近年来众多学者对CaSR的研究为我们研究肾结石的形成机制提供了新思路。

CaSR是在20余年前被发现的，能够维持生理机体离子钙浓度，其在肾脏中高表达，与尿钙吸收、排泄密切相关，也在肾脏之外的脏器中表达如骨、甲状腺等[13-14]。CaSR在肾脏排泄钙离子的过程起着关键作用[15]。

实验发现，乙二醇组造模期间有2只大鼠死亡，此结果可能于乙二醇及氯化铵的肾毒性有关。造模早期各组大鼠无特殊变化；造模3～8周时，正常对照组无特殊表现，乙二醇组出现烦躁，活动增加。第8～10周乙二醇组出现精神疲倦，活动度减少，食量减少；正常对照组无特殊表现，此表现可能与乙二醇及氯化铵造成肾脏损伤有关。肾脏病理切片发现，乙二醇组大鼠肾脏内从第3周起可见钙盐结晶沉积， 主要分布于肾小管， 而1～10周正常对照组大鼠肾组织未见晶体， 乙二醇组结石分析成石率较正常对照组高。乙二醇组肾脏肾小管内钙盐晶体沉积较多，伴有部分肾小管上皮细胞空泡样变性及小管上皮肿胀，可见肾间质淋巴细胞浸润或肾小管上皮脱落；正常对照组肾脏组织未见病理改变。此结果与传统乙二醇+氯化铵造模机制[16]相符，但本实验的成石率却较其低，因为本研究每周都处死大鼠，在处死的未形成大鼠里面有形成结石的可能。Western blot结果显示乙二醇组肾脏CaSR的表达和对照组无明显差异，但是3～10周乙二醇组肾脏CaSR的表达量明显比正常对照组多，且差异有统计学意义。升高的CaSR能够抑制肾小管对钙离子的重吸收，从而导致高钙尿，影响结石的形成[4-5]。这表明CaSR表达增强可能在结石形成中起重要作用。与以往乙二醇建立肾结石模型观察CaSR的表达相比较，本实验动态观察CaSR的表达，增加结果可信度。

综上所述，Wistar雄性大鼠在乙二醇灌胃2周后，CaSR的表达量逐渐增加，其抑制肾小管对钙离子的重吸收，增加尿钙，促进结石的形成。但CaSR是如何具体影响钙离子排泄的，其具体作用机制仍有待进一步深入研究。