羟基磷灰石诱导脂肪间充质干细胞成骨分化的实验研究

程胜承，刘义，景亚青，鞠明艳，李光

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的单克隆成体干细胞，可以在一定诱导条件下向成肌、成脂、成骨、成软骨等多个方向分化［1］。MSCs具有支持造血、低免疫原性等优势［2］，可用于自体或同种异体治疗［3］。MSCs分布广泛，骨髓、脂肪、骨片、牙髓、胎盘、脐带等多种组织中均可分离培养出MSCs［4］。其中，骨髓来源的MSCs——骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是目前研究最为清楚的MSCs之一，但是可提取的细胞数量相对较少，传代能力较弱，通常传代次数不超过6～10代［5］。脂肪来源的MSCs——脂肪间充质干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）因来源较容易、细胞数量较多、增殖能力较BMSCs更强，且对生物体的损伤也更小，近年来被广泛应用［6］。然而，相对于BMSCs，较弱的成骨能力限制了ADSCs在骨相关疾病中的治疗作用。羟基磷灰石［Ca10（PO4）6（OH）2］（hydroxyapatite，HA）是人或动物骨骼和牙齿无机质的主要成分，在人体的骨骼中质量分数约为60%，而在牙齿中可高达95%以上［7］。人工合成的HA的组成和结晶结构均类似于人体自然骨骼，并且相态比较稳定、无毒性，不会引起炎症反应，具有良好的生物活性和生物相容性，适用于引导骨骼的生长［8］，因此近年来成为了骨修复的良好材料之一［9］。本文通过研究HA对ADSCs成骨能力的影响，以拓展ADSCs在骨组织工程中的应用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 6周龄C57BL/6雄鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（含酚红）、Ⅰ型胶原蛋白酶、胎牛血清［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］，离心机（艾本德中国有限公司），水浴锅（天津欧诺仪器股份有限公司），40µm细胞筛（美国康宁公司），鼠源抗体（北京安必奇生物科技有限公司），光学倒置显微镜［尼康仪器（上海）有限公司］，Nanodrop 2000、逆转录试剂盒［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］，恒温细胞培养箱［雅马拓科技贸易（上海）有限公司］，酶标仪（上海Bio-Rad Laboratories有限公司），碱性磷酸酶检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），实时荧光定量逆转录PCR仪（上海睿铂赛生物科技有限公司），CCK-8试剂盒（北京智杰方远科技有限公司），羟基磷灰石粉末（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 ADSCs原代分离培养 选取6周龄无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级的野生型C57BL/6雄鼠，麻醉后颈椎脱臼法处死，用体积分数75%的乙醇浸泡5 min。在无菌操作台中，使用剪刀和镊子剥离小鼠腋下、腹股沟皮下和附睾周围脂肪组织。将分离的脂肪组织放置在培养皿中，用含有青链霉素的PBS冲洗2～3次，洗去杂质，并快速剪碎脂肪团块。用0.2%的Ⅰ型胶原酶溶液于37℃恒温摇床200 r/min消化0.8～1 h，加入含0.2%胎牛血清的α-MEM细胞培养基终止消化反应。用孔径为40µm筛网滤去脂肪残块，细胞悬液收集至50 mL离心管中。1 500 r/min离心5 min，弃上清，用含15%胎牛血清的α-MEM细胞培养基重悬细胞沉淀，并将悬液移至10 cm培养皿中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2 ADSCs的纯化及传代培养 脂肪细胞培养72 h后，吸去3 mL培养液，并加入3 mL新的培养液。培养96 h后吸去培养液，并用PBS洗2遍，再加入6 mL含有1%青链霉素混合液、15%胎牛血清的α-MEM培养基，以后每隔48 h更换1次培养液。待原代细胞密度长至90%左右，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，按照1∶2的比例进行传代。

1.2.3 ADSCs的鉴定 （1）取培养至第二代的ADSCs，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液37℃处理4 min，加入含0.2%胎牛血清的α-MEM细胞培养基终止消化，1 500 r/min离心5 min收集细胞。弃上清，将收集到的细胞用PBS重悬，再次1 500 r/min离心5 min收集细胞。重复以上操作1次。（2）再次将收集到的细胞沉淀用1 mL的PBS重悬，平均分配到5个1.5 mL无菌无酶的EP管中（200µL/管），1 500 r/min离心5 min，弃掉上清液，使用剩下的50µL PBS继续重悬细胞，分别将 5个 EP 管标记为：Blank、FITC-CD45、PE-CD44、PECD29、PE-Sca1，分别加入相应鼠源抗体1µL（抗体放置于冰箱内4℃保存）。（3）4℃避光孵育30 min，加入200µL PBS后，1 500 r/min离心5 min，弃掉上清，加入200µL 4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）重悬细胞并固定1 h，，固定完成后，1 500 r/min离心5 min，弃掉PFA，用PBS重新悬浮细胞，4℃冰箱保存，以待流式细胞仪测试。

1.2.4 HA细胞毒性检测 将ADSCs提前接种至96孔细胞培养板中（1×104个/孔），24 h后细胞完全贴壁，按浓度梯度（0、5、10、20、50、100、500 mg/L）加入配制好的HA悬浮液，37℃、5%CO2培养24 h后，每孔加入10µL CCK-8试剂，继续培养4 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度（A）值。

1.2.5 HA对ADSCs的成骨诱导作用 将分别含有0、5、10、20、50、100、500 mg/L的HA混合液以每孔500µL接种到24孔细胞培养板中，静置4 h后每孔接种6×104个ADSCs。置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后取出，观察细胞的贴壁情况。之后每48 h更换含5%胎牛血清的α-MEM细胞培养基，15 d后完成诱导过程，使用4%PFA固定30 min后，对细胞进行碱性磷酸酶染色，并观察染色结果。

1.2.6 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测HA对ADSCs成骨能力的影响 Trizol法提取HA成骨诱导15 d后ADSCs的总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。qRT-PCR测定经HA诱导的ADSCs成骨相关基因骨钙素（BGLAP）、碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（COL1A1）、骨桥蛋白（OPN）、Runt相关转录因子2（Runx2）mRNA表达量，引物序列见表1。反应条件：95℃5 min；95 ℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。通过熔解曲线分析初步鉴定PCR反应的特异性。数据的收集由实时荧光定量逆转录PCR仪自带软件完成，采用2-ΔΔCt法进行数据分析，以0 mg/L的HA诱导组数据作为参照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，组间数据比较用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验法。P＜0.05时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADSCs的生长情况 原代细胞培养至72 h，显微镜下观察到较多的脂肪滴及过滤沉淀杂质，见图1A。72 h后，细胞的数量开始增多，96 h时可见大部分细胞呈梭形或多边形，不规则贴壁生长，并有较多圆形细胞悬浮，见图1B。传代后细胞增殖的速度加快，细胞呈长梭形，细胞质有突起且丰富，细胞轮廓清晰，整体呈旋涡状排列，具有典型的ADSCs形态特点，见图1C、D。

Tab.1 Primer for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物列表

Fig.1 Isolation and culture of primary ADSCs(×100)图1 原代ADSCs的分离培养（×100）

2.2 ADSCs的鉴定 结果显示，造血干细胞表面标志物FITC-CD45（1.23%）阴性表达，间充质干细胞表面标志物PE-CD29（98.8%）、PE-CD44（81.4%）、PESca1（81.3%）阳性表达，见图2。

2.3 HA对ADSCs增殖的影响 加入CCK-8检测试剂4 h后，加入HA的培养基颜色变化如图3A～G，0、5、10、20 mg/L这4个梯度培养基的颜色变化差异较小，从50 mg/L开始颜色变淡，说明较高浓度的HA会抑制ADSCs的增殖。HA≤20 mg/L时，对细胞的生长无明显影响，见图3H。

2.4 HA诱导ADSCs成骨分化 经HA诱导15 d的ADSCs进行ALP染色，结果显示0 mg/L HA诱导组未出现蓝色，20 mg/L HA诱导组染色面积最大，证明有较好的诱导成骨分化作用，见图4。

Fig.2 Flow cytometry detection of ADSCs图2 流式细胞仪检测ADSCs

Fig.3 The effect of HA on the proliferation of ADSCs图3 HA对ADSCs增殖的影响

Fig.4 ALPsecretionofADSCsinducedbydifferentconcentrationsofHA图4 不同浓度HA诱导ADSCs后ALP的分泌量变化

2.5 qRT-PCR结果分析 通过对诱导ADSCs基因表达量检测，分析了不同浓度HA对ADSCs成骨相关基因表达的影响，见图5。与0 mg/L组相比，其余各组 ALP、COL1A1、OPN、Runx2表达均升高，在BGLAP中，与0 mg/L组相比，20 mg/L表达升高，100 mg/L表达降低，其余各组无差别。与20 mg/L组相比，5 mg/L、50 mg/L、100 mg/L组中BGLAP的表达量降低，COL1A1的表达量无差别。

3 讨论

目前，MSCs是临床应用范围最广、安全性最高的干细胞之一，其来源十分广泛，从骨髓、脂肪、牙髓、真皮、软骨膜、关节软骨、脐带、胎盘等众多组织中均可分离提取。ADSCs主要来源于脂肪组织，容易大量获取细胞，在近年来的研究中越来越受关注［10］。

3.1 ADSCs具有成骨分化的能力 ADSCs具有来源充足、免疫原性低［11］、体外容易培养、增殖能力较强的特点。有研究显示，经过多种诱导因子的加入，可以使ADSCs向成骨细胞诱导分化，以此来治疗骨损伤［12］。原代ADSCs多呈集落样贴壁生长，细胞形态呈长梭形或多边形［13］。ADSCs完成原代集落形成后即可稳定扩增。经过成骨诱导的ADSCs通常会表达ALP和COL1A1，随后在基质中出现钙沉积，进而形成钙结节。COL1A1的分泌是增殖期开始的标志，成骨细胞分化早期的标志是ALP的分泌，分泌量越高，说明其活性越高，向成骨细胞分化的能力越强［14］。

3.2 HA具有成骨诱导能力 目前，HA作为骨组织工程中的常用支架材料，可与多种MSCs和生物因子混合制作成种类繁多的骨修复材料［15-16］，并且HA对成骨细胞有较强的黏附性，可以促进成骨细胞的增殖［17］，以及细胞外基质的分泌，调节修复部位的微环境，促进胶原形成，进而促进骨折损伤后修复［18-19］。有研究表明，利用HA与COL1A1支架与BMSCs共培养21 d后，通过电镜扫描分析，发现支架上形成了大量的矿物沉积，部分细胞发生钙化，说明HA对BMSCs具有良好的成骨诱导能力［19］。

Fig.5 Osteogenic gene expression of ADSCs induced by hydroxyapatite图5 经HA诱导后的ADSCs成骨基因表达

3.3 HA对ADSCs具有成骨诱导作用 本文针对HA对ADSCs的成骨分化能力进行探究，选用了7个浓度梯度来观察不同量的HA对ADSCs的影响，结果表明，在≤20 mg/L时，HA对ADSCs的增殖影响较小。随后通过ALP染色，观察HA对ADSCs的诱导成骨分化作用，结果显示，经HA诱导的细胞均被染上蓝色，说明HA具有诱导ADSCs成骨分化的能力［20-21］。为了进一步验证成骨分化能力，qRT-PCR检测了成骨相关基因的表达情况，结果显示，20 mg/L的HA诱导ADSCs向成骨细胞分化的作用最明显，成骨相关基因的表达明显升高。BGLAP是骨组织的特异性蛋白，也是骨细胞分化成熟的标志。HA为20 mg/L时，BGLAP表达较高，结合所有基因的表达情况，证明HA可以诱导ADSCs向成骨细胞分化。

综上所述，HA具有诱导ADSCs向成骨细胞分化的能力，为两者混合制作成新的骨支架修复材料提供了理论基础。