胆道闭锁患儿肝纤维化及炎症细胞浸润与Kasai术后胆管炎的关系

熊希倩，詹江华，胡晓丽，齐美娇

胆道闭锁（biliary atresia，BA）是危及婴幼儿生命的肝胆系统疾病之一，以肝内外胆管进行性炎症、纤维性梗阻及胆汁淤积为特点，可导致进行性肝纤维化和肝硬化，是婴幼儿时期肝移植的主要指征。BA患儿如未接受及时治疗，常在2岁内死亡［1-2］。虽然Kasai手术的普及显著提高了BA患儿的自体肝生存率，术后胆管炎仍是最常见且最难处理的并发症［3］。反复发作的胆管炎导致BA患儿的自体肝生存情况不理想。Shimadera等［4］证实肝纤维化程度与Kasai术后早期胆管炎发作关系密切，肝内胆管局部纤维化引起肝内胆汁排出减少，易引起术后胆管炎发作。蒋宏等［5］发现BA患儿的肝组织和纤维斑块存在CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润，手术吻合部位存在炎症，这成为术后胆管炎的发病基础。肝纤维化、肝组织炎性浸润与Kasai术后胆管炎有关，但两者与胆管炎的具体关系还不清楚。本文旨在阐明肝纤维化分级及炎症细胞浸润程度与Kasai术后胆管炎的关系，为预测Kasai术后胆管炎的发生提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 标本来源与分组 收集天津市儿童医院普外科2015年1月—2016年12月间经胆道造影确诊为BA，且行Kasai手术的患儿92例，其中男43例，女49例；出生后初次出现黄疸时间为0～30 d；Kasai手术时日龄34～97 d，中位日龄59 d。本研究经天津市儿童医院伦理委员会讨论通过。肝组织标本取自肝右叶前缘。标本经苏木素/伊红（HE）、马松（Masson）染色，按照日本Ohkuma’s肝纤维化分级标准进行分组：0级，无纤维化；Ⅰ级，肝门管区轻度纤维化；Ⅱ级，临近门管区轻度桥接纤维化；Ⅲ级，伸向临近门管区中度桥接纤维化；Ⅳ级，肝硬化、假小叶形成。肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级例数分别为8、31、35、18例。

1.2 主要试剂与仪器 兔抗人CD8单克隆抗体、小鼠抗人CD4、LCA、CD68单克隆抗体、二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/小鼠IgG聚合物、3,3’-diaminobenzidine，3,3-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。定量分析所用的ImagePro Plus 6.0自动分析系统购自美国Media Cybernetics公司。

1.3 实验方法

1.3.1 肝组织标本处理 取BA患儿肝右叶前缘，经10%福尔马林溶液固定，8～24 h后经石蜡包埋储存，所有过程均处于同一实验条件。

1.3.2 HE染色 病理切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水洗，苏木素浸染5 min，经酸化伊红乙醇液浸染2 min，梯度乙醇脱水，透明剂浸泡至透明，中性树胶封片等一系列操作。在光学显微镜下（×200）观察肝组织细胞形态、炎性细胞分类和形态、胆管增生程度、肝纤维化程度等。

1.3.3 Masson染色 病理切片脱蜡至水，苏木素染7 min，流水稍洗，1%盐酸乙醇分化，流水冲洗3 min，丽春红酸性品红液染8 min，蒸馏水稍冲洗，1%磷钼酸水溶液处理5 min，直接用核苯胺蓝复染5 min，1%冰醋酸处理1 min，95%乙醇脱水多次，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片等一系列操作。在光学显微镜下（×40）观察肝纤维化程度。

1.3.4 免疫组化染色 病理切片脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复15 min，冷却至室温，PBS冲洗5 min×3次，于3%H2O2中37℃孵育10 min，再用PBS冲洗5 min×3次，滴加一抗［白细胞共同抗原（LCA）、T淋巴细胞表面抗原（CD4、CD8）、巨噬细胞特异性抗体（CD68）］，于冰箱中4℃过夜，次日取出置于室温30 min，PBS洗5 min×3次，加二抗后37℃孵育30 min，PBS洗5 min× 3次，经DAB显色5～10 min，镜下（×100）观察染色情况，充分水洗，苏木素液染核，脱水、透明、中性树胶封片。

免疫组化阳性标准：（1）定性分析。根据染色强度分为无棕黄色（阴性）、淡棕黄色（弱阳性）、棕黄色（阳性）、棕褐色（强阳性）。（2）半定量分析。肝组织切片内阳性细胞总光密度值/阳性细胞所占面积求得平均光密度（AOD）值。切片内读取任意5张视野，用同一计算机成像系统留取相同倍数显微镜下图片，ImagePro Plus 6.0分析图片，计算CD4、CD8、LCA、CD68蛋白的AOD。

1.4 胆管炎诊断标准 胆管炎诊断标准：出现无其他部位感染的发热（体温＞38.5℃）、进行性黄疸、无胆汁便，血常规示白细胞及C反应蛋白（CRP）升高，血清胆红素升高。术后1个月内发生胆管炎为早期胆管炎。术后半年内胆管炎发作3次及3次以上为频发胆管炎。术后黄疸持续不退的BA患儿均视为早期胆管炎和频发胆管炎。

1.5 术后随访 患儿术后每月复查1次，3个月后病情稳定改为每2～3个月复查1次，复查内容包括血常规、肝功能、腹部彩超等。自体肝生存1年以上，可疑门静脉高压患儿建议行胃镜检查。

1.6 统计学方法 所有数据均应用SPSS 17.0软件包进行统计处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较满足方差齐性采用Bonferroni法，方差非齐性采用Tamhane’s法；多组间率的比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肝纤维化分级中对应的手术时日龄 肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级患儿手术时日龄分别为（49.33±8.64）d、（52.55±15.06）d、（59.83±10.80）d、（90.19±5.86）d，4组间比较差异有统计学意义（F=41.728，P＜0.05），其中肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级均低于Ⅳ级，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 HE染色结果 肝组织HE染色可见炎性细胞浸润以淋巴细胞为主，肝纤维化分级为Ⅱ、Ⅲ级的BA患儿炎性浸润程度相对较轻，见图1。

Fig.1 HE staining results of hepatic fibrosis of grade Ⅰ～Ⅳ (×200)图1 肝纤维化Ⅰ～Ⅳ级HE染色结果（×200）

2.3 Masson染色结果 结果显示，Ⅰ级纤维条索没有桥接，仅限于1个汇管区（图2A）；Ⅱ级2个相邻的汇管区纤维条索轻度桥接（图2B）；Ⅲ级伸向临近汇管区中度桥接纤维化，但假小叶尚未形成（图2C）；Ⅳ级原有的肝小叶结构破坏，假小叶形成（图2D）。

Fig.2 Masson staining results of hepatic fibrosis of grade Ⅰ～Ⅳ (×40)图2 肝纤维化Ⅰ～Ⅳ级Masson染色结果（×40）

2.4 LCA、CD4、CD8与CD68免疫组化结果 LCA蛋白标记所有的淋巴细胞（包括T淋巴细胞和B淋巴细胞等），其在所有汇管区和肝组织均呈强阳性表达，呈棕褐色（图3A）；CD4蛋白在所有汇管区和肝组织均呈阳性表达，呈棕黄色（图3B）；CD8蛋白主要在汇管区呈阳性表达，呈棕黄色（图3C）；CD68蛋白在汇管区和肝组织存在表达，呈棕褐色，表达强阳性（图3D）。

Fig.3 The immunohistochemical staining results of LCA,CD4,CD8 and CD68（×100）图3 LCA、CD4、CD8与CD68免疫组化染色结果（×100）

2.5 LCA、CD4、CD8及CD68免疫组化半定量分析结果 LCA、CD4、CD8及CD68在不同肝纤维化分级表达情况见表1。LCA、CD4、CD8三种蛋白的表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）。LCA、CD4蛋白在肝纤维化Ⅳ级BA患儿肝组织的表达含量明显高于肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，Ⅰ级高于Ⅱ、Ⅲ级；CD8蛋白肝纤维化Ⅳ级BA患儿肝组织的表达含量明显高于其他3组（P＜0.05）；CD68蛋白的表达水平在不同的肝纤维化分级组中差异无统计学意义（P＞0.05）。

Tab.1 Expressions of LCA,CD4,CD8 and CD68 proteins in different grade groups表1 LCA、CD4、CD8及CD68蛋白在不同肝纤维化分级组中的表达 （OD值，±s）

Tab.1 Expressions of LCA,CD4,CD8 and CD68 proteins in different grade groups表1 LCA、CD4、CD8及CD68蛋白在不同肝纤维化分级组中的表达 （OD值，±s）

＊＊P＜0.01；a与Ⅰ级比较，b与Ⅱ级比较，c与Ⅲ级比较，P＜0.05

肝纤维化分级Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级Ⅳ级F n 83 1 35 18 LCA 0.115±0.015 0.093±0.007a 0.101±0.007a 0.130±0.010abc 40.957＊＊CD4 0.111±0.007 0.072±0.003a 0.067±0.005a 0.096±0.010abc 92.164＊＊CD8 0.066±0.005 0.061±0.007 0.067±0.004 0.082±0.006abc 36.532＊＊CD68 0.120±0.028 0.136±0.031 0.113±0.018 0.125±0.026 0.821

2.6 Kasai术后胆管炎发生情况 92例BA患儿均获得短期随访，本组中有50例患儿发生胆管炎；早期胆管炎38例；频发胆管炎23例。不同肝纤维化分级BA患儿Kasai术后胆管炎、早期胆管炎和频发胆管炎的发生率差异有统计学意义（P＜0.05），肝纤维化Ⅳ级患儿术后胆管炎、早期胆管炎和频发胆管炎发生率均高于Ⅱ级（P＜0.008 3），见表2。

Tab.2 The incidence of cholangitis after Kasai surgery表2 Kasai术后胆管炎发生情况 ［例（%）］

3 讨论

胆管炎作为Kasai术后常见又难以处理的并发症，多在术后早期发生，其发生率约为60%～90%［6］。胆管炎反复发作严重影响Kasai手术效果，防治胆管炎对改善BA患儿预后、延长自体肝生存时间具有重要意义［7］。董淳强等［8］认为在肝门部炎症较稳定且肝纤维化程度较轻时进行Kasai手术能获得良好的胆汁引流，证实胆管炎的发生与行Kasai手术时肝纤维化程度和肝组织的炎性浸润密切相关。

3.1 肝纤维化分级与Kasai术后胆管炎的关系 本研究中肝纤维化Ⅱ、Ⅲ级BA患儿Kasai术后发生胆管炎比例较低，早期发生胆管炎的情况较少，基本上没有频发胆管炎的发生，而肝纤维化Ⅳ级患儿术后胆管炎发生率最高，早期胆管炎和频发胆管炎比较常见。本研究结果证实肝纤维化程度与早期胆管炎发作关系密切。肝纤维化严重时，肝门部纤维斑块中开放细微胆管的数量相应减少，肝内胆管局部因肝纤维化导致区域引流障碍，直接导致胆汁排出通畅性降低，易引起术后早期胆管炎发作［4，9］。本组中肝纤维化Ⅰ级BA患儿Kasai术后胆管炎的发生率较Ⅱ、Ⅲ级高。肝纤维化较轻时，肝门部纤维斑块形成不佳，纤维斑块剥离后剩余的肝门部胆管缺乏支撑，容易再次发生闭塞，增加Kasai术后胆管炎发生率［10］。彭飞等［11］认为肝门部存在纤维斑块的BA患儿术后黄疸消退率及2年自体肝存活率明显高于缺乏纤维斑块的患儿，肝门部较多的小胆管起到相对较好的胆汁引流作用，减轻了胆汁淤积对肝脏的持续损伤，提高了患儿生存质量。因此，肝纤维化Ⅰ级BA患儿Kasai术后胆管炎发生率较肝纤维化Ⅱ、Ⅲ级BA患儿高的原因可能与已经开放的胆管缺乏支撑，再次发生梗阻有关。

3.2 肝组织炎性细胞浸润与Kasai术后胆管炎的关系 Kasai术后胆管炎与炎性细胞浸润的关系研究普遍围绕T淋巴细胞亚群展开。本研究结果证实BA患儿肝组织炎性细胞浸润以淋巴细胞为主，还存在少量的巨噬细胞，可见淋巴细胞浸润程度与术后胆管炎发生关系密切。

LCA蛋白在淋巴细胞中表达，但因其表达的特异性差，相关研究不多。Mack等［12］发现BA患儿肝组织中CD4+T细胞在汇管区表达明显高于正常的肝组织。Sakamoto等［13］发现BA动物模型肝门淋巴结中CD4+调节性T细胞聚集，是外周血的2倍左右。Guo等［14-15］认为CD8+T细胞能促进胆管上皮细胞的破坏，加快炎性进程，在BA纤维化中发挥重要作用。本研究证实LCA、CD4、CD8表达水平随着肝纤维化程度的加重呈先下降后上升的趋势，即肝纤维化分级为Ⅱ、Ⅲ级，上述蛋白表达量较低，说明此时淋巴细胞尤其是T淋巴细胞浸润较轻。结合Kasai术后胆管炎的随访资料，此时胆管炎的发生率也较低，可以推测Kasai术时肝组织的炎性浸润程度可以作为Kasai术后胆管炎发生的一个预测指标。但Derkow等［16］发现 CD8+T 细胞越少，CD4+/CD8+比例越低的BA患儿预后越差。因此，CD8+T淋巴细胞的表达量与胆管炎发生的关系还需要进一步实验来验证。本研究证实Kasai术后胆管炎发生与Kasai术时肝组织CD4+T淋巴细胞浸润有关，与文献报道的结论一致。

综上，Kasai术后胆管炎与肝纤维化程度和肝脏炎性浸润密切相关，肝组织肝纤维化程度和炎性细胞表达水平可以作为预测Kasai术后胆管炎的发生的重要指标之一，可以用于指导胆管炎预防用药。