新型导电复合材料聚吡咯壳聚糖对新生大鼠心室肌细胞钙信号传导的影响及可能机制

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在世界范围内，冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease，CHD)是引起心肌梗死(myocardial infarction，MI)、导致心力衰竭(heart failure，HF)发生的主要原因[1]，其致死率、致残率依然处于第一位，给个人、家庭、社会带来了沉重的经济和心理负担，严重威胁人类健康[2-4]。心肌梗死及其导致的心力衰竭治疗一直是临床工作的重点和难点；改善心脏功能、延缓心力衰竭等终末期心脏病的发生逐渐得到心血管专家的共识[5]。心肌梗死后大量心肌细胞死亡，由于心脏自身的再生能力限制，梗死及其周边区域被瘢痕组织取代，引起健康心肌组织与瘢痕组织缺乏正常的电信号通路，导致心脏电信号传播异常、不同步的心脏活动和收缩，最终发展为心力衰竭[6]。如何在治疗心肌梗死同时改善该部位电传导，越来越得到医学界的重视。有学者将导电聚合物注射到动物心肌梗死部位，观察到心律失常的次数及严重程度有所降低[7-8]。

聚吡咯具有金属和半导体特性，在神经系统和骨关节中已经开展了相关研究[9-10]；在心血管系统还未有报道。本研究旨在探讨聚吡咯壳聚糖(polypyrrole-chitosan，Ppy-Chi)对新生大鼠心室肌细胞(NRVM)的钙介导电传导速率的影响及作用机制，明确其生物安全性，评估是否能作为心脏植入材料的候选材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料 98%吡咯、低分子壳聚糖(Chi)、甘油磷酸二钠、25%戊二醛、六水三氯化铁、胰酶、DAPI、SARC抗体、Cx-43抗体(美国Sigma公司)；Ⅱ型胶原酶(加拿大Worthington公司)；胎牛血清、细胞培养基DMEM/F12、Fluo-4(美国Gibco公司)；Percoll分离液(美国GE公司)；新生大鼠[山西医科大学实验动物中心提供，许可证号SYXK(晋)2015-001]。

1.2 方法

1.2.1 Ppy-Chi合成 2 g Chi溶于50 mL浓度为0.18 mol/L醋酸溶液中，400RPM搅拌2 h后，300 μL纯度为98% Pyrrole在搅拌的同时缓慢加入，搅拌过夜；加入5 mL含有0.9 g三氯化铁溶液，40 ℃旋转状态下反应48 h，0.1× PBS 溶液透析3次，去除多余的铁离子及吡咯单体；50%甘油磷酸钠调整Ppy-Chi溶液pH值至6左右，取500 μL Ppy-Chi溶液加入适量0.4%戊二醛溶液后，在细胞培养皿上形成均匀涂层，备后续实验用，2% Chi溶液作为对照材料。

1.2.2 Ppy-Chi近红外光谱分析 制成1 mm厚Ppy-Chi、Chi薄膜，用玛瑙研磨体充分研磨，置于测试台上，10 T/cm2加压3 min，应用红外光谱仪(Nicolettm iStm 50，美国赛默飞公司)对上述样品进行测量(分辨率4/cm，扫描64次)。通过系统自带软件绘制近红外光谱图，通过特征谱线分析材料组分。

1.2.3 新生大鼠NRVM分离及鉴定 采用复合酶液法分离新生大鼠心室肌细胞，通过Percoll液密度梯度离心法纯化NRVM，按0.5×106/cm2浓度接种在空白培养皿、Phi-Chi培养皿、Chi培养皿中，在37℃，5%CO2和95%空气中培养；5 d后固定行SARC、Cx-43免疫荧光染色，共聚焦显微镜(日本尼康公司)拍照观察。

1.2.4 Ppy-Chi导电复合材料的生物相容性 将成功分离的NRVM细胞按0.5×106/cm2密度接种在空白培养皿、Phi-Chi培养皿、Chi培养皿中，分别在第1天、第5天时通过DAPI染色进行细胞计数(n=3)。

1.2.5 NRVM钙介导的电信号传导速率检测 将NRVM在Phi-Chi培养皿、Chi培养皿中共培养5 d后，PBS洗涤3次，用5 mmoL/L Fluo-4标记30 min，再次洗涤去除多余Fluo-4染料，置于高速电子倍增耦合成像系统(Evolve128，美国Photometrics公司)中检测，激发光488 nm，放大率0.6，记录3 s视频，约1 500帧图像；应用Image J(Version 1.51w 13，美国NIH提供)分析，在Phi-Chi、Chi记率的视频中选取两个距离相等的感兴趣区，观察二者之间钙介导的电传导信号传递需要的时间，计算二者间电传导率(n=3)。

1.2.6 Ppy-Chi导电性测定 添加不同浓度戊二醛溶液将Ppy-Chi、Chi在培养皿中形成相同厚度水凝胶，置于半导体导电率测试台(HP4155，美国惠普公司)上，用两探针循环伏安法测定材料导电率，两探针间距7 mm，择双线性Sweep模式，按电压范围设定为(-5～5)V，间隔100 mV，Conpline 10 mA，持续时间2 s，延迟100 μs设定测量，每一个样品在不同位置测量3次，用设备自带软件绘制每种材料V-A曲线，选取在曲线起始端近视成直线的点，求出其斜率，按公式计算出导电率，每个样本取3次测量的平均值纳入统计(n=3)。

2 结 果

2.1 Ppy-Chi导电材料的大体视图及化学组成 应用单电子氧化还原剂三氯化铁可以将单体吡咯与壳聚糖形成聚合物Ppy-Chi，具体合成原理详见图1-A，聚吡咯结合在壳聚糖-CH2O-或-NH-基团上；应用FTIR红外光谱分析发现，在950/cm、1 064/cm可以观察到N-C、C-O-C二者的特征频率，在1 654/cm可以观察到N-H键的存在，证明材料合成成功(见图1-B)；2% Chi为微黄透明溶液，Ppy-Chi为黑色溶液(见图1-C)；加入适量0.4%戊二醛可与使Ppy-Chi在室温下形成凝胶(见图1-D)。

A为 Ppy-Chi合成示意图，B为Ppy-Chi和Chi的FTIR光谱图，C为Chi、Ppy-Chi液体状态大体视图，D为Ppy-Chi形成凝胶大体观。

2.2 NRVM分离及鉴定 应用Collagenase TypeⅡ，Trypsin，DNase混合酶体系和PecoⅡ分离液能够从第一天新生乳鼠得到高纯度NRVM，将其培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F-12完全培养基中；第3天，光镜下观察到，细胞成簇状生长，可见多个凸起，并与相邻细胞相连接，并能表现出节律性跳动(见图2-A)。将纯化的NRVM接种在空白培养皿中、含有Chi涂层的培养皿和含有Ppy-Chi涂层的培养皿中，培养5 d后，进行心肌细胞标记物染色发现，在上述3种培养四表面，NRVM都能正常表达心肌标记物SARC和Cx-43(见图2-B)，且差异无统计学意义。

A为大鼠NRVM细胞原代培养3 d后明场照片(×40)；B为 SARC和Cx-43免疫荧光染色观察NRVM在3种培养表面的表达情况(红色SARC，绿色Cx-43，蓝色细胞核DAPI； ×600)。

2.3 Ppy-Chi导电复合材料的生物相容性 将相同数量NRVM分别培养于空白、Chi、Ppy-Chi涂层的培养皿中(n=6)，于第1天、第5天DAPI标记细胞核后，荧光显微镜下观察细胞数量(见图3-A)，每个时间点选取3个样本，每个样本在高倍镜下选取3个视野进行统计；发现在第1天、第5天培养过程中，3种培养表面数量变化不明显，且3种培养表面之间NRVM数量差异无统计学意义(见图3-B)，证实含有Chi、Ppy-Chi涂层的培养表面与常规细胞培养皿有良好的生物相容性。

A为DAPI标记NRVM在空白、Chi、Ppy-Chi涂层的培养皿培养情况(×40)；B为在培养1 d、5 d时3种培养表面上NRVM数量变化不明显。

2.4 Ppy-Chi导电复合材料对大鼠NRVM电信号传导影响 与培养在Chi涂层上NRVM Ca2+介导的电传导率相比，Ppy-Chi组电传导率是前者的3倍[11.82±1.45)mm/s与(37.74±13.3)mm/s]。详见图4。

A为大鼠NRVM Chi、Ppy-Chi材料表面电信号传导随时间变化图；B为NRVM在Chi、Ppy-Chi表面电信号传导速度。

2.5 Ppy-Chi导电复合材料导电率 将Chi、Ppy-Chi在35 mm培养皿中形成厚度为5 mm凝胶，按图5-A示方法置于半导体测试仪工作台上，两探针间距7 mm，应用循环伏安法测试材料阻抗；图5-B示，Chi、Ppy-Chi两种材料导电率明显不同，Chi导电率为(18.21 ±6.13)×10-5S/cm， Ppy-Chi导电率(89.27±16.97)×10-5S/cm。后者约为前者的4倍，证实Ppy-Chi具有优良导电性能。详见图5-B。

A为检测方法示意图；B为Ppy-Chi、Chi导电率。

图5 Ppy-Chi、Chi导电率比较

3 讨 论

由于成人心肌细胞仅有微弱的再生能力，耐低氧能力差，当心脏冠状动脉血管发生栓塞时，所供应区域的心肌细胞大部分发生凋亡，被瘢痕组织取代，残存的心肌细胞形成孤岛；由于瘢痕组织与正常心肌组织电阻抗不同，残存心肌孤岛不能进行有效电信号传递，将发生不同类别的心律失常，引起心脏功能受损。已有研究表明通过注射生物材料可以改善心脏功能，延缓心力衰竭的发生[11-12]。由于本研究中注射的生物材料导电性弱，改善心脏电活动效果不明显，限制了其有效性和使用范围。

在可注射生物材料中添加一种导电聚合物来改善心脏电生理活动成为一种有益的尝试，通过增强瘢痕组织的电传导性，将孤立心肌团链接起来，实现同步收缩，进而缩短QRS间期，使心脏心电图趋于正常。有学者对多种导电聚合物在生物组织工程领域开展了深入研究，主要包括Ppy、聚苯胺(Polyaniline，PANI)、聚乙烯二氧噻吩[Poly(3，4-ethylenedioxythiophene)，PEDOT]、聚噻吩(Polythiophene，PTh)、聚乙烯(Polyacetylene，PAc)、聚呋喃(Polyfuran，PFu)等[7，13]。而Ppy由于合成相对容易，导电率高，因此研究相对广泛。有研究表明基于Ppy导电复合材料能够增加内皮细胞黏附和生长，介导电信号对内皮细胞的刺激作用[14]。然而，Ppy对脆弱的心肌细胞能否表现出良好生物相容性和介导心肌细胞间电信号传递还不清楚，需要深入探讨。

本研究通过氧化还原法合成了基于Ppy导电聚合物Ppy-Chi，用FTIR证实材料合成成功；用复合酶化学消化法和Percoll密度梯度离心法相结合，能够分离出高纯度NRVM；与空白培养皿和Chi涂层表面相比较，NRVM数量和心肌标记蛋白SARC、Cx-43比较差异无统计学意义；而钙介导的心肌细胞电传导速度明显快于Chi组；通过对材料导电率分析发现，Ppy-Chi导电率是Chi的4倍，可能是电信号在高导电率材料Ppy-Chi上传导较快于高阻抗Chi。

体外研究证实Ppy-Chi与NRVM具有良好的生物相容性，不影响心肌细胞标志物表达，能够加快心肌细胞间电信号传导，是较为理想的心脏可注射生物材料。本研究仍存有不足，如未能阐明Ppy-Chi是通过何种机制促进心肌细胞间钙介导的电信号传导、材料物理电化学属性如何转化为细胞生物电信号、在大鼠心肌梗死模型中应用的效能评价等，这将成为课题组将来研究的切入点。