小麦紫色素的提取工艺、抗氧化活性及其在毛发染色中的应用

杨三维, 赵佳佳, 乔 玲, 郑兴卫, 芦艳珍, 李刘军, 张建诚*

1.山西省农业科学院小麦研究所, 山西 临汾 041000；2.山西省农业科学院旱地农业研究中心, 太原 030031

小麦(TriticumaestivumL.)是我国最重要的粮食作物之一，其籽粒颜色有白、红、紫、深紫、蓝、蓝紫、黑紫等，其中，紫粒小麦是因种皮紫色素积累而产生的。紫色素作为植物次生代谢物,是一类水溶性的类黄酮化合物，不仅具有鲜艳的颜色,而且具有较强的抗氧化作用，同时，可预防心血管疾病等的发生，对人体具有一定的保健作用[1]。

目前，饮料、食品等行业使用的着色剂大多为合成色素，而合成色素往往具有致癌、致突变等副作用，易对人体健康产生不良影响[2]。随着经济的发展、人民生活水平的提高和健康意识的加强，食用天然原料的产品将会成为今后食品消费的主流[3]。天然色素是最理想的着色剂，且具有营养价值和药理作用。从植物中提取的紫色素安全、无毒，具有抗突变、抗氧化、降血压、保护肝脏、预防癌症、增加食品营养成分和延长保质期的作用，主要用作食品的着色剂，如饮料、腌渍品、果冻、乳饮料、怡糖制品和保健品等[1,3]。近年来，随着植物紫色素应用范围的不断拓宽，对其的需求量急剧增长，日本和韩国都以高价收购植物紫色素用于医药和食品领域[4]。目前，植物紫色素主要是从紫薯、甘蓝和紫玉米中分离提取，但这些方法多以新鲜植物为原材料，受季节的影响较大。而从紫粒小麦中提取天然紫色素，是以小麦麦麸为原料，成本较低、便于贮藏和运输，且不易受环境因素的影响。

现阶段，植物紫色素的提取主要采用酸碱抽提、超声萃取等方法，但酸碱溶液分步提取法存在提取率低、活性差的缺点，且酸碱液对后续的纯化设备也会产生较大的损害[5]。同时，也有利用超声波和复合酶等方法提取色素的报道[6]，具有周期短、得率高的特点，但尚未应用于实际生产中。而已知的对于紫粒小麦种皮色素的组成及其含量的研究较少，且仅限于实验室水平，如利用酸化乙醇法提取紫色小麦麸皮色素[7]，但在强酸性条件下提取，易导致色素变性，丧失生物学功能。在弱碱条件下提取植物色素的研究也有报道[5]，但尚未应用于小麦色素的提取。因此，寻找、开发高纯度小麦紫色素的提取工艺具有重要意义。为了提升紫粒小麦的综合利用价值，本文提供了1种高纯度、低成本、便简化的小麦紫色素提取工艺，并研究了提取的小麦紫色素的抗氧化活性及其在毛发染色中的应用，以期为小麦紫色素的生产应用提供新方法和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试材料 选用目前推广范围较广的2个品种：宁春46号、农大3753，种植于本单位试验田，6月初正常成熟收获。将2个品种1∶1混匀后进行测定。

1.1.2试验试剂： 浓盐酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠和十六烷基三甲基溴化铵等化学试剂均为分析纯，购自北京化工厂。鲁米诺试剂购于上海宝曼生物科技有限公司。

1.1.3试验仪器： WFJ-15型麦麸粉碎机(江苏佳科机械有限公司)；L(P)GZ型立式离心机(江苏赛德力制药机械制造有限公司)；RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；UV2450型紫外分光光度计(日本岛津公司)；JP-200V型真空泵(海扬真空设备有限公司)；有机纳滤膜(美国海德能公司)；SP-1500型喷雾干燥器(上海顺仪实验设备有限公司)；JY138型电感耦合等离子体原子发射光谱仪(法国Jobin Yvon Division公司)；Z5000型原子吸收光谱仪(日本日立公司)；LSC-LB7型液体闪烁仪(日本日立公司)。

1.2 原料预处理

用麦麸粉碎机将紫粒小麦麦麸粉碎，过300目筛，作为提取原材料于室温干燥条件下贮藏备用。

1.3 紫色素提取

1.3.1碱水浸提，离心获得粗提液 将粉碎后的细麦麸粉与1.5% NaOH溶液按1∶4(g/mL)的比例混合，充分搅拌，随后每隔20 min搅拌1次，室温条件下(25～30℃)提取1 h，然后用100目过滤器过滤。每份麦麸原料用以上方法分别浸提3次、过滤3次，最后将3次所得的滤液全部混合。

将收集的混合滤液冷却至10～12℃后，加入浓盐酸，调节滤液pH至4，然后将滤液经10 000 r/min离心10 min后弃沉淀，去除上清液中膜状漂浮物后即获得紫色素的粗提液。

1.3.2紫色素的吸附解吸、离心浓缩 在pH 4的酸性环境下，用大孔吸附树脂吸附粗提液中的紫色素，搅拌吸附2 h后过滤滤液，随后利用浓度为60%～65%(V/V)的乙醇溶液解吸树脂中已吸附的紫色素，解吸30 min后，过滤树脂，得到洗脱液。将洗脱液倒入滤杯中，启动真空泵抽滤，使用耐乙醇的有机钠滤膜对洗脱液进行浓缩，得到体积浓缩至10%左右的浓缩液。

1.3.3紫色素的蒸发浓缩 采用旋转蒸发器对浓缩液进行蒸馏浓缩，设置真空度为0.9 MPa左右，使浓缩后的体积达到原浓缩液体积的40%为止，再将蒸馏浓缩后的溶液经10 000 r/min离心10 min后去除沉淀物，即得到紫色素提取液。

1.3.4喷雾干燥 对得到的紫色素提取液进行干燥处理，设定干燥器进风温度为140℃，出风温度为60℃，采用电加热补偿辅助干燥，收集紫色素粉末后称重，以色素重/麦麸重(g/kg)计算紫色素得率。

1.4 单因素实验设计

以提取时间、料液比和提取次数为自变量，紫色素提取量为响应值进行单因素试验。具体参考鞠瑶瑶等[8]单因素试验优化紫色素提取工艺的参数。

1.5 紫色素纯度和色价测定

采用紫外分光光度计在波长280～600 nm检测紫色素纯度，观察吸收峰。取1 g紫色素干粉溶解于30 mL的30%乙醇溶液中，用pH 3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解并定容至100 mL，通过测定520 nm处的吸光值(A)计算色价值。吸光值在0.2～0.8之间为有效数据，以pH 3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液为对照，色价Ecm%=A×稀释倍数。

1.6 紫色素抗氧化活性检测

在含有H2O2的鲁米诺发光体系中，检测不同浓度小麦紫色素对活性氧的清除率，进而计算其IC50(IC50是指清除率为50%时所需的紫色素浓度)。在测定瓶中依次加入100 μL 5 mol/L H2O2和500 μL 0.2 mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.7)，再分别加入0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL、0.9 mg/mL和0.95 mg/mL的小麦紫色素，将双蒸水作为空白对照；混合均匀后加入5 mol/L鲁米诺和10 mol/L十六烷基三甲基溴化铵的等量混合液(500 μL)以启动反应，随后置于液闪测定仪中，延时10 s，测定12 s内的发光强度。按照下式计算清除率：

清除率=(空白对照值-样品值)/空白对照值×100%

1.7 紫色素重金属含量检测

采用电感耦合等离子体(inductively coupled plasma，ICP)-原子发射光谱仪和原子吸收光谱仪检测色素提取物中的重金属含量。元素标准溶液(100 μg/mL)由国家标准溶液(NCS)稀释而成，试验用水为去离子水。ICP分析条件：谱线波长As=193.7 nm，工作功率1 250 W，入射狭缝18 nm，出射狭缝79 nm，进样速率1.5 mL/min，载气压力0.25 MPa，护套气量0.18 L/min，冷却气流量18 L/min。原子吸收分析条件：灯电流7.5 mA，狭缝1.3 nm，燃烧器高度7.5 mm，火焰类型为贫燃。提取物中金属总含量通过比色法测定，按照国家标准《有机化工产品中重金属的测定》(GB/T 7532-2008)进行[9]。

1.8 紫色素羊毛染色

将洗净的白色羊毛放入0.1 mol/L Na2CO3预处理液中，静置10 min，再分别在0.08 mol/L的MgSO4、FeSO4、AlCl3和FeCl3金属离子媒染剂中处理10 min后洗净，最后放入浓度为3 g/L的紫色素溶液中染色10 min，观察其颜色变化。

2 结果与分析

2.1 小麦紫色素提取工艺的优化

在小麦紫色素的提取过程中，影响其得率的因素主要为提取时间、提取温度、提取次数和料液比。为保持紫色素的化学稳定性，在室温条件(25～30℃)下对紫色素提取工艺进行优化。以提取时间、料液比和提取次数为自变量，紫色素提取量为响应值进行单因素试验。

当料液比为1∶3(g/mL)时，随着提取时间延长，紫色素得率增加；当提取时间超过60 min后，紫色素得率开始呈下降趋势(图1A)。这可能是由于提取时间过长，原材料组织中大量的细胞破裂，细胞内大量不溶物及黏性物质混入提取液中，导致提取液中杂质增多、黏度增强，反而影响了紫色素的溶出；另一方面，随着提取时间延长，紫色素的多糖分子链C6-C3-C6骨架断裂，导致其在后续醇沉处理过程中损失增大，降低了紫色素得率[8]，由此确定紫色素的最佳提取时间为60 min(图1A)。

在提取时间为60 min的条件下，麦麸粉与1.5% NaOH溶液以不同比例混合进行提取(图1B)，随着1.5% NaOH溶液用量的增加，紫色素得率也明显提高，原因可能是溶剂比例的增加可有效降低溶液的黏度，提高了浓度差，有利于紫色素分子的扩散 ；而进一步增加料液比使粗提液中色素浓度降低，导致后续大孔吸附树脂吸附率降低，可见，料液比为1∶4(g/mL)时，麦麸紫色素的提取效果较为理想。

图1 不同条件对紫色素提取率的影响Fig.1 Effects of different factors on the yield of purple pigment.

在料液比1∶4(g/mL)、提取时间60 min的条件下，进一步研究了提取次数对紫色素得率的影响，从图1C中可以看出，随着提取次数的增加，紫色素得率升高，但提取次数超过3次后，得率呈下降趋势。最后，于室温条件(25～30℃)下，采用优化后提取条件：提取时间60 min、料液比1∶4(g/mL)、提取3次，提取的紫色素得率为3.11 g/kg。

2.2 小麦紫色素紫外光谱分析

紫色素为糖配体，分子量较大，易导致提取物中含有大量的多糖、蛋白质和淀粉，从而极大地限制了紫色素的应用。从图2中可以看出，提取的紫色素样品在310～355 nm处和520～540 nm处，出现了与花青素和花色苷一致的较强吸收峰。其中，310～355 nm处花青素酰基结构的特征峰峰位显著，表明本研究提取的紫色素纯度较高。此外，经计算，小麦紫色素色价为91。

2.3 小麦紫色素相关指标测定

为了明确紫色素中的重金属含量，先采用比色法测定总金属含量，再利用原子吸收光谱仪和离子体原子发射光谱仪测定铅和砷等物质的含量。检测结果见表1，重金属总含量小于24 μg/g，远低于国家标准(40 μg/g)；铅和砷等毒性较大的金属离子均未检出；干燥失重仅为5.9%，灰分成分为2.1%，各项指标均达到了商业化的标准[9,10]。植物色素大多从植物根茎、叶片等组织提取，这类组织为植物代谢的主要器官，次级代谢产物和酶的含量往往较高，常导致色素中含有较多重金属。而本工艺是以麦麸为原料，提取种皮中累积的色素，因此重金属含量较低。

图2 紫色素紫外图谱扫描曲线Fig.2 Scanning curve of ultraviolet spectrum of purple pigment.

表1 紫色素提取物性质检测Table 1 The property of purple pigment.

2.4 小麦紫色素抗氧化活性评价

在含有H2O2的鲁米诺发光体系中加入小麦紫色素后，体系的发光强度降低，表明紫色素具有清除活性氧的作用；随着加入的紫色素浓度的升高，对活性氧的清除率也有所上升。以清除率对紫色素浓度作图(图3)，可得小麦紫色素的IC50为1.436 g/L，表明小麦紫色素具有较强的清除H2O2的能力，即具有较高的抗氧化活性。

2.5 小麦紫色素羊毛染色

针对小麦紫色素应用的研究开展较少，未见其用于毛发染色的报道。本工艺提取的小麦紫色素具有较高的纯度和色价，羊毛染色结果表明，紫色素与不同金属元素作用可将羊毛染成不同颜色(图4,彩图见图版四)：MgSO4-紫色素显紫红色，FeSO4-紫色素显淡黄色，AlCl3-紫色素显深蓝色，FeCl3-紫色素显棕黑色。

图3 不同质量浓度对活性氧的清除作用Fig.3 The scavenging effects on active oxygenic of purple pigment with different concentration.

图4 紫色素羊毛染色样品Fig.4 Purple pigment applied to dyeing wool.

3 讨论

从紫粒小麦中提取的天然色素对人类安全无毒，且具有较强的着色性和稳定性，可直接用于食品、化妆品等行业[10～13]。同时，研究表明，小麦紫色素具有预防心脑血管疾病以及抗癌的作用[1,4]。目前，紫粒小麦种植面积逐年增加，主要用来加工面粉。虽然富含紫色素的麦麸产量大，但利用率较低，基本都用作动物饲料，造成了原料的廉价消耗[2,4]。常见的小麦紫色素提取方法为酸碱抽提法，如唐晓珍等[7]采用酸化乙醇浸提法，提取的紫色小麦紫色素得率为(0.87±0.21)g/kg，高建伟等[14]使用酸性甲醇浸提以及孙群[15]与李杏普等[16]等使用酸性水浸提；也有利用超声波法、微生物降解、酶法、微生物纤维素菌细胞破壁法以及高温提取的研究[17～20]，如傅虹飞等[21]利用超声波辅助提取，提取的小麦紫色素得率为(1.82±0.23)g/kg，是普通浸提法的2倍。但由于麦麸中含有较多的淀粉和蛋白质，加之酸碱裂解，导致提取的紫色素活性较低，极大的限制了小麦紫色素的开发和利用。本文采用将碱水裂解与大孔树脂吸附、有机钠滤膜浓缩相结合的方法，使小麦紫色素得率提高为3.11 g/kg，高于之前已有方法，为小麦紫色素的进一步利用奠定了基础。在抗氧化活性方面，张立伟等[22]发现连翘活性物质对活性氧具有较强的清除能力，而本工艺提取的小麦紫色素对H2O2清除能力高于连翘皂甙(1.618 g/L)。此外，金属元素分析结果表明，提取的小麦紫色素重金属含量较低，达到了国家食品药品的相关标准。综上所述，本工艺提取的小麦紫色素的体外抗氧化活性高、重金属含量低，在抗氧化功能性食品或功能因子添加剂方面具有较大的开发潜力。

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