氢分子对宫颈癌细胞HeLa的影响

商 蕾, 李佳腊, 苏泽华, 谢 飞, 马雪梅

北京工业大学生命科学与生物工程学院, 北京氢分子研究中心, 北京 100124

全球范围内宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，占所有女性恶性肿瘤发病的13%，居妇科恶性肿瘤发病率首位。在我国，每年约有13万新发宫颈癌患者，年发病率占全球总数的28%以上。它已成为15～44岁年龄段女性恶性肿瘤发病第二的疾病，且越来越趋向年轻化[1]。目前，宫颈癌的治疗主要采用手术、化疗、放疗综合治疗的方法，有效的化疗能提高治愈率，降低复发和转移风险，同时在基因治疗[2]、生物靶向治疗[3]、热疗[4]以及介入治疗[5]等新技术方法逐步应用于宫颈癌患者的治疗当中后，宫颈癌患者的生存率和生活质量也在逐渐提高和改善。2008年，Saitoh等[6]在实验中研究中性pH富氢电解水对肿瘤细胞的作用，发现氢分子可以显著降低人舌癌细胞HSC-4的细胞克隆形成率(72%)以及克隆细胞数(66%)，并且不影响正常细胞的增殖。与传统抗肿瘤化疗药物相比，氢分子对人体十分安全。传统的抗肿瘤药物为多靶向药物，存在一定的副作用，会降低患者的生活质量，现有结果表明，氢分子的使用是安全无毒的[7]。其次，不同于其他抗肿瘤物质和药物，氢气本身结构非常简单，代谢产物也简单安全，例如氢气与羟自由基反应可以生成水，而多余的氢气则可以通过呼吸排出体外。再者，一般的抗肿瘤药物需要通过消化道吸收等过程，达到其血药峰值的时间较长，而氢分子在体内能够快速扩散到需要保护或治疗的组织，能够在较短的时间内达到浓度峰值。最后，氢分子给药方式多样，它可通过不同的给药方式发挥治疗作用，如呼吸氢气、饮用富氢水、注射饱和氢生理盐水等方式，目前都有相关研究[8]。本研究采用含氢培养基对人宫颈癌细胞进行处理，CCK-8法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况，划痕实验和Transwell实验分别检验细胞迁移和侵袭的能力，研究氢分子对细胞的影响，从而为氢分子预防和治疗宫颈癌、提高宫颈癌病人的生存率以及改善生活质量提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

氢水棒购于水素水科技发展有限公司；DMEM(高糖)培养基购于美国Hyclone公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、青链霉素(100X)、0.25%Trypsin-EDTA、B27、EGF和bFGF购于美国Gibco公司；细胞周期和凋亡检测试剂盒购于美国Millipore公司；Matrigel基质胶购于美国BD公司；细胞培养瓶、离心管、Transwell培养小室等购于美国Corning公司；人宫颈癌细胞系HeLa来自北京同为时代生物科技有限公司；CCK-8购于东仁化学科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1含氢培养基的制备 将灭菌后的氢水棒放入培养基中，密封瓶口，待2 d氢气达到饱和后使用。

1.2.2细胞培养 HeLa细胞株在氮中保存，需要复苏时取出，立即置于37℃的水浴锅中，轻轻晃动冻存管使其内冻存的细胞液迅速融化，之后将细胞液转移至含有10倍体积新鲜DMEM培养基的15 mL离心管中，混合后于离心机中800 r/min 离心5 min后弃上层培养液，加入1～2 mL含10%FBS的培养基重悬细胞。然后将HeLa细胞接种于含4～6 mL的普通培养基的25 cm2细胞培养瓶中，放置于37℃、饱和湿度、含5% CO2的细胞培养箱中进行培养，按1∶3～1∶5进行传代。进行实验分组时，分为对照组(CK)和含氢培养组(HM)。

1.2.3细胞计数方法 采用台盼蓝染料浸染细胞来进行细胞计数。使用前用无水乙醇清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干，将盖玻片覆盖在计数板上；用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞，制成单个细胞悬液，吸取10 μL左右待测细胞悬液至1.5 mL离心管中，稀释一定倍数，再加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混匀，静置约1～2 min；将混合液混合均匀，吸取少量液体从计数板一侧边缘缓缓滴入，使混合液充满计数板和盖玻片之间的空隙，注意加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡，在细胞加入到血球计数板后，稍后片刻置于显微镜下观察，在低倍镜下(10×10倍)观察计数；用计数器来计算计数板四角的4个大方格中的活细胞数目，按公式细胞浓度(个/mL)=(4个方格内的细胞总数/4)×2×104×稀释倍数来计算细胞的浓度。

1.2.4克隆球形成实验 收集对数生长期的HeLa细胞，计数，用无血清DMEM/F12普通培养基稀释细胞悬液至2×103/mL。六孔板中按CK和HM组分别加入2 mL 无血清培养基(加入1× B27、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF)，每孔加入500个细胞，之后放于37℃、含5% CO2的饱和湿度的培养箱中培养。根据情况每隔3 d适当添加培养液，培养7～10 d。待形成明显的克隆球停止实验，将六孔板放置在倒置显微镜下观察，在低倍镜下(40×)计数直径大于50 μm的克隆球，随机拍摄5张克隆球照片，使用显微镜拍照软件测量克隆球直径。

1.2.5克隆形成实验 取处于对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，将细胞吹打悬浮在含10%FBS的培养液中备用。然后将细胞悬液作梯度倍数稀释，以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种于含8～10 mL的37℃预温DMEM培养液的小皿中，轻轻转动使细胞分散均匀。放置于37℃、饱和湿度、含5% CO2的细胞培养箱中培养10～14 d左右。每3天左右进行观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时终止培养。弃去上清培养液，用PBS溶液轻轻浸洗2次。再用4%多聚甲醛溶液固定细胞15 min。弃去固定液，加适量结晶紫染色液染细胞2～3 min左右，用流水缓慢洗去染色液，然后空气干燥。将平皿倒置，用肉眼直接计克隆数，或在显微镜(低倍镜40×)计数大于10个细胞的克隆数，在低倍镜下随机拍摄5张平板克隆照片，使用显微镜拍照软件测量克隆直径。

1.2.6细胞活性测定(CCK-8法) 取处于对数生长期的HeLa细胞计数，调整细胞浓度至5×104/mL，以每孔100 μL细胞量接种于96孔板，共接种60孔。置于37℃、饱和湿度、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，根据实验分组每孔换普通培养基或者含氢培养基，继续培养0 h、6 h、24 h、48 h、72 h。在每个检测时间点每孔加10 μL CCK-8试剂，继续培养反应1 h。使用酶标仪于450 nm波长处检测吸光度OD值。根据公式计算平均抑制率，确定氢分子对HeLa细胞活性的影响。

细胞存活率(%)= [(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

As:试验孔(含细胞、含氢培养基、CCK-8)；Ac:对照孔(含细胞、普通培养基、CCK-8)；Ab:空白孔(不含细胞、普通培养基、CCK-8)

1.2.7细胞免疫荧光 收集对数生长期的细胞，计数，用全血清培养基稀释细胞悬液至5×104/mL，5万细胞每孔接种于6孔板中的细胞玻片上。置于37℃、饱和湿度、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，根据实验分组每孔更换普通培养基或者含氢培养基，继续培养24 h。取出6孔板，加入PBS洗2次，4%多聚甲醛室温固定15 min。吸掉孔中多聚甲醛，PBS常温洗2次，加入新鲜稀释的0.3%的Triton X-100通透10 min。吸掉通透液，PBS洗1遍，滴加10%山羊血清工作液，室温封闭30 min。吸去山羊血清，加入1∶200稀释的anti-Vimentin抗体(空白对照加入PBS，实验组加入抗体)，4℃湿盒中孵育过夜。取出湿盒，恢复至室温，小心吸掉一抗，PBS洗3次，每次5 min。加入1:500稀释的荧光二抗，室温避光孵育1 h。PBS避光洗3次，每次5 min，滴加Hoechst进行核染色5 min，PBS洗1遍，取出细胞玻片，荧光显微镜下观察并在40× 镜下拍照。

1.2.8细胞周期检测 收集对数生长期的细胞，计数，用全血清培养基稀释细胞悬液至2×105/mL，20万细胞每孔接种于6孔板中。置于37℃、饱和湿度、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，根据分组每孔换成普通培养基或者含氢培养基，继续培养24 h。取出6孔板，将培养基收集在15 mL离心管中，PBS溶液清洗2次后收集细胞，用500 μL PBS溶液重悬，逐滴加入到10 mL 70%的冰乙醇中，置于冰箱4℃过夜。取出固定后的细胞，1 000 r/min离心5 min，去掉固定液，PBS洗2次，加入200 μL 细胞周期检测试剂，室温避光反应20 min后，流式检测。

1.2.9细胞凋亡检测 收集对数生长期的细胞，计数，用全血清培养基稀释细胞悬液至2×105/mL，20万细胞每孔接种于6孔板中。置于37℃、饱和湿度、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，根据分组每孔换普通培养基或者含氢培养基，继续培养24 h。取出6孔板，将培养基收集在15 mL离心管中，PBS洗2次，收集细胞后使用1 mL含有1%FBS的PBS洗2遍，离心后用100 μL含有1%FBS的PBS重悬，加入100 μL细胞凋亡检测试剂，室温避光反应15 min后，流式检测。

1.2.10细胞划痕实验 取对数期生长的细胞，细胞消化后计数，每孔50万细胞接入6孔板，于37℃、含5% CO2的饱和湿度的培养箱中培养一段时间，待细胞长满板底后，用200 μL的黄枪头垂直于孔板沿直线制造细胞划痕，尽量使每个划痕的宽度一致。轻轻吸走培养液，用PBS溶液缓慢冲洗孔板3次，洗去划痕产生的细胞碎片。然后分组加入1%FBS的普通培养基和含氢培养基，将培养板放入培养箱中继续培养，在划痕后的0 h、24 h拍照记录。尽量在同一位置拍照。根据收集的图片数据分析实验结果。

1.2.11细胞侵袭实验 首先进行基质胶铺板：将Matrigel胶用无血清无双抗的培养基1∶6稀释，取50～100 μL包被Transwell小室底部膜的上室面(小心滴加，不能产生气泡)，置于37℃ 孵育30 min左右，使Matrigel聚合成凝胶。使用前先进行基底膜水化。凝胶时可以制备HeLa细胞悬液：取处于对数期的细胞消化，终止消化后离心弃去培养液，用1 mL PBS溶液洗1～2次，再用含有1% FBS的培养基重悬。调整细胞密度至3.5×105/mL(制备细胞悬液前可先让细胞去血清饥饿12～24 h，去除血清的影响，但这一步非必须)。接种细胞：24孔板下室加入650 μL含10%FBS的培养基，Transwell上层小室均匀地轻轻加入300 μL细胞悬液(需注意下层培养液和小室间不要有气泡产生，否则会使下层培养液的趋化作用减弱甚至消失，故在种板时要留心，如果出现气泡，将小室提起去除气泡，再将小室放回培养板即可)。将培养板小心地放入培养箱中培养48 h，取出小室，弃去孔中培养液，PBS溶液洗2次后用4%多聚甲醛室温固定20 min，将小室适当风干，放在500 μL 0.1%结晶紫染色液的孔中，染色20 min左右，用棉签轻轻擦掉上层未浸润的细胞，PBS溶液洗2次。 进行结果统计：在100倍显微镜下观察细胞并随即拍下5个视野(一般采用左上、左下、右上、右下、中央5个视野)，记数。

1.3 统计学分析

本实验采用统计软件GraphPad Prism 6.01分析所有数据资料。在符合正态性和方差齐性的前提下，以均数±标准差(M±SD)进行统计学描述；统计推断则采用t检验。

2 结果与分析

2.1 氢分子对HeLa细胞悬浮克隆球形成的影响

本实验无血清方法培养悬浮克隆球，通过在培养基中添加氢分子，探讨氢分子对细胞克隆球形成的影响，结果如图1所示。

图1 氢分子对细胞悬浮克隆球生长的影响(4×)Fig.1 Effect of molecular hydrogen on suspension cloning ball change of HeLa cell(4×).

图1表示氢分子对HeLa细胞克隆球形成的情况。图1A是培养板中HeLa细胞形成克隆球的情况，发现HeLa细胞无明显克隆球形成，但是可以形成细胞集落，加入含氢培养基后，细胞集落数量明显变少；图1B和图1C为接种细胞形成细胞集落的计数图和平均直径图，由图1可以看出，加入氢分子后，细胞集落数量显著减少，同时细胞集落直径明显变小(P<0.001)，说明氢分子对HeLa细胞的克隆球形成有抑制作用。

2.2 氢分子对HeLa细胞克隆球形成的变化

细胞克隆形成率可以检测细胞接种后贴壁的细胞成活并能够形成克隆的数量，已有研究证实，细胞贴壁后不一定都能增殖并且形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞，克隆形成率是反映一种细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状的常用实验方法。本研究采用平板克隆实验检验氢分子对贴壁后的细胞形成克隆能力的影响，从而研究氢分子对肿瘤成瘤率的影响。实验结果如图2所示。

图2 氢分子对细胞克隆形成的影响Fig.2 Effect of molecular hydrogen on clone formation.

图2表示氢分子对HeLa细胞的克隆形成的影响，图2A为部分细胞长成的单克隆形成数量，加入含氢培养基后，HeLa细胞的克隆形成数显著减少(P<0.001)；图2B和图2C为接种细胞形成克隆的计数图和细胞形成克隆的平均直径大小图，结果表明，氢分子能够显著抑制HeLa细胞的克隆形成数量，且由图中可得，HeLa细胞克隆直径在加入氢分子后显著减小。这些结果说明氢分子可能抑制HeLa细胞的克隆形成，对抑制癌症的生长可能具有一定的作用效果。

2.3 含氢培养基对HeLa细胞生长速率和形态学变化的影响

本实验采用含氢培养基处理HeLa细胞不同时间段，CCK-8法检测氢分子对不同细胞活性的作用，本实验只监测了细胞72 h内的增殖情况，实验结果如下图3、图4(彩图见图版一)所示。

图3表示氢分子对HeLa细胞生长的作用。与CK组相比，氢分子处理细胞后，HeLa细胞在前24 h内的生长受到明显抑制，HM组细胞增殖速率明显低于CK组；48 h内HM组增殖速率保持与CK组相同，随后HM组细胞的增殖速率高于CK组，但在72 h内细胞的活性始终低于CK组。结果表明氢分子能在一定程度上抑制细胞的生长。

图4表示氢分子对HeLa细胞波形蛋白表达变化的影响。波形蛋白(vimentin)是细胞中间丝的一种，从细胞核到细胞膜呈放射状分布，在维持和调节细胞功能中起着非常重要的作用，其参与肿瘤细胞的侵袭、转移、分化以及细胞凋亡等过程，有研究表明，波形蛋白的表达与细胞增殖能力、粘附能力以及迁移和侵袭能力成正相关。氢分子处理HeLa细胞后，少部分细胞扁圆，细胞密度降低，细胞变小，波形蛋白表达量减少。这表明氢分子可引起中间丝波形蛋白的表达，进而影响细胞的粘附和细胞形态。

2.4 含氢培养基引起HeLa细胞周期和凋亡的变化

本实验采用不同培养基处理HeLa细胞24 h，通过流式细胞术检测细胞周期及不同时期细胞凋亡的变化，探讨氢分子对肿瘤细胞周期和凋亡的影响，结果如图5表示。

图5表示氢分子对HeLa细胞周期和凋亡的影响及其柱状图，可以看出HeLa细胞的G0/G1时期细胞数量有减少的趋势，但与对照组相比并无显著差异，S期细胞数量显著减少，且G2/M期细胞显著增加。因此，氢分子处理HeLa细胞后，可能通过减少S期分裂以及G2/M期阻滞影响细胞周期；且与CK组相比，HeLa细胞在氢分子处理后，只有晚期凋亡细胞有增加的趋势，说明氢分子处理对HeLa细胞的主要作用可能是促进其晚期凋亡。

图3 氢分子对HeLa细胞生长速率的影响Fig.3 Effect of molecular hydrogen on growth rate of HeLa cell.

图4 氢分子对HeLa细胞波形蛋白的影响(40×)Fig.4 Effect of molecular hydrogen on vimentin expression of HeLa cell(40×).(彩图见图版一)

2.5 含氢培养基对HeLa细胞迁移的影响

细胞迁移是机体正常生长发育的生理过程，是正常细胞的基本功能之一，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。癌症转移与肿瘤细胞的迁移能力息息相关。本研究采用划痕实验，加入含氢培养基处理HeLa细胞，观察0 h和24 h时细胞迁移的情况，进而观察氢分子对肿瘤细胞迁移能力的影响，实验结果如图6所示。

图6表示氢分子对HeLa细胞迁移的影响。经过24 h的培养，细胞开始向中间移动，加入氢培养基后，HeLa细胞的迁移能力显著降低(P<0.001)。结果表明氢分子对HeLa细胞的迁移具有一定的抑制作用。

2.6 含氢培养基引起HeLa细胞浸润的变化

肿瘤细胞侵袭实验(tumour invasion assay)主要用于研究恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响因素和机制。本研究采用Transwell实验研究细胞侵袭，加入含氢培养基处理细胞系，观察细胞浸润的情况，从而观察氢分子对HeLa细胞侵袭能力的影响，实验结果如图7(彩图见图版一)所示。

图5 氢分子对HeLa细胞周期和凋亡的影响Fig.5 Effect of molecular hydrogen on cell cycle and apoptosis of HeLa cells.

图6 氢分子对HeLa细胞迁移的影响Fig.6 Effect of molecular hydrogen on cell migration of HeLa cells.

图7表示氢分子HeLa细胞的侵袭结果，图7A为穿过Transwell小室基底膜的细胞显微镜下的结果，染色越深说明细胞穿过基底膜的数量越多；图7B为穿过小室的细胞计数。细胞计数结果表明，加入含氢培养基后，HeLa细胞的穿孔细胞数显著减少(P<0.05)，说明氢分子可能抑制肿瘤细胞的侵袭，对抑制癌症的转移具有一定的效果。

图7 氢分子对细胞浸润的影响Fig.7 Effect of molecular hydrogen on cell invasion.

3 讨论

对于宫颈癌，总的治疗原则是以手术和放疗为主、化疗为辅的综合治疗方法，目的是为了提高盆腔的局部控制率，降低术后的复发率和转移率，进而增加患者的5年生存率。近年来，大量循证医学研究发现，同步放化疗可以降低宫颈癌局部复发和远处转移率，改善患者生活质量，延长患者生存时间，目前已被美国国立癌症研究所推荐为宫颈癌治疗标准[3]。药物疗法和放射治疗虽然是癌症治疗的重要手段，但是化疗药物的针对性较弱，在杀伤肿瘤细胞的同时，也在不同程度上损伤了正常的组织和细胞，易导致人体不同程度的不良反应。放射治疗过程中产生较多的活性氧，导致患者的氧化应激和炎症水平升高[9]，引起较多副作用，易导致患者生活质量下降。现有研究证明，氢分子与放化疗联合使用，能够在不影响放化疗疗效的基础上提高化疗药物的作用效果并减少放化疗过程中的副作用。临床上，杨庆玺[10]对多种癌症患者进行对照研究，饮用富氢水对恶性肿瘤病人有减毒增效的作用。通过让化疗患者在服药期间饮用15 d富氢水，他们发现富氢水对包括肺癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌在内的多种癌症患者化疗的副作用均有所降低，能够保护骨髓，保护胃肠道、肝肾、心肌功能，改善化疗后引起的体能下降等情况。这些结果显示出氢分子在减轻化疗副作用、提高药效和改善患者生活质量方面具有较好的潜在应用价值。富氢水有潜力通过有效地减轻化疗药物的副作用，提高化疗过程中患者的生活质量。Kang等[11]通过让放疗期间肝癌患者饮用6周富氢气水，显著降低了肝癌患者血液中活性氧的代谢产物，维持了血液中的氧化电势，患者的生活质量评分显著提高，同时两组患者的肿瘤本身的反应未发现不同，因此说明氢分子可以通过减少辐射诱导的氧化应激反应来减少放射治疗的副作用。

本研究从氢分子单独处理HeLa细胞的角度来观察，发现氢分子可以改变细胞形态，抑制其增殖、迁移和侵袭能力，影响细胞周期，促进细胞的凋亡，进而说明氢分子能够抑制肿瘤的生长和癌症的转移，对宫颈癌的发生发展可能具有防治作用。且氢分子价格低廉，获得容易，安全无毒。从安全性和经济性的角度来看，氢分子很可能成为肿瘤治疗及预防的一种良好的辅助性手段，且极具应用前景。采用呼吸氢气、引用富氢水等相关健康产品或许可以作为临床上癌症预防的新方法和肿瘤治疗的新手段。