ATF4在CCl4和LPS/D⁃GalN介导小鼠肝损伤中的保护作用

秦蜀 陈润 赵晓芳 王勇 向远彩 罗国松 周虹 代荣阳 张春燕

西南医科大学附属医院1肝胆外科，4体检中心（四川泸州 646000）；西南医科大学2公共卫生学院社会医学教研室，3肝脏疾病实验室，5基础医学院生物化学与分子生物学教研室（四川泸州646000）

转录激活因子4（ATF4）属于与 cAMP反应元件（CRE）结合的C/EBP转录因子家族［1］。ATF4是一个主要的转录因子，它的时序性表达和活动处于严格的细胞控制之下。ATF4的翻译受到真核翻译起始因子2α的调节（eIF2α）［2］。在正常情况下，由于半衰期短，ATF4蛋白质很快就会被蛋白酶体降解。在应激条件下，eIF2α的磷酸化导致翻译普遍被抑制，但ATF4 mRNA的翻译却显著上调［3-4］。ATF4参与多种生物学过程的调节，包括细胞氨基酸代谢、成骨细胞分化和氧化应激反应［1，5-7］。体内证据表明ATF4在糖代谢、胰岛素敏感性和脂代谢中起着重要作用［8-10］。肝损伤是肝炎、肝硬化、肝癌等多种肝病的共同发病过程［11］。诱导肝损伤的危险因素很多，如肝炎病毒、酒精、药物等。虽然已经知道应激反应等信号调控分子可以介导肝脏损伤［12-13］，但肝脏损伤的确切机制仍不清楚。在本实验研究中，我们观察到正常小鼠肝脏中应激调控分子ATF4蛋白呈高水平。CCl4和LPS/D⁃GalN诱导肝损伤后，肝脏ATF4蛋白水平下降。此外，本研究还证明了CRISPR⁃Cas9介导的ATF4敲低对CCl4和LPS/D⁃GalN诱导的小鼠肝损伤有明显促进作用。

1 材料与方法

1.1 药品和抗体 衣霉素购自Tocris（Minneapolis，MN，USA）；CCl4购自国药（中国，北京）；LPS和D⁃GalN 购自 Sigma⁃Aldrich（St.Louis，MO，USA）；ATF4、p⁃eIF2α 和 Bip抗体 购 自 Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）；eIF2α和 GAPDH抗 体 购 自 Santa Cruz Biotechnology（Heidelberg，Germany）。

1.2 动物及处理 雄性C57BL/6小鼠20～22 g购自南京大学动物模型研究中心（中国，南京，MARC）。本研究中动物的使用已获单位动物伦理委员会批准，动物伦理批号：20160003。

1.3 质粒尾静脉高压注射 尾静脉高压注射按照文献［14］报告中所述进行。简而言之，ATF4靶向的CRISPR⁃Cas9 质粒或空载体 10 μg稀释到 2 mL盐水（0.9%NaCl），经过0.22 μm滤膜过滤，并在5～7 s内注入10周大的雄性C57BL/6小鼠的侧尾静脉。

1.4 CCl4肝损伤模型 如前所述，雄性C57BL/6小鼠腹腔内注射CCl4（4 mL/kg，以5%浓度在橄榄油中溶解），每周3次，共2周［15］。在最后1次注射CCl4后的24 h后处死小鼠，收集肝脏等组织用于实验。

1.5 LPS/D⁃GalN肝损伤模型 雄性C57BL/6小鼠腹腔内注射LPS（50 μg/kg）和D⁃GalN（800 mg/kg），在LPS/D⁃GalN注射后6 h处死小鼠［16］，收集肝脏等组织用于实验。

1.6 逆转录反应和实时PCR 根据制造商的说明，用TRIZOL试剂（Invitrogen）分离总RNA。按照制造商说明，使用M⁃MLV逆转录酶（Promega，Madison，WI，USA）进行逆转录反应。如前所述，采用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，Tokyo，Japan）进行实时定量PCR分析［15］。使用18S对结果进行标准化。使用的引物如下：小鼠ATF4⁃forward：TCCTGAACAGCGAAGTGTTG；小鼠 ATF4⁃reverse：AGAGCT CATCTGGCATGGTT；小鼠 18S⁃forward：CGGCTACCACATCCAAGGAA；小 鼠 18S⁃reverse：GCTGGAATTACCGCGGCT。

1.7 Western blot 将小鼠组织溶解到Triton裂解缓冲液中（20 mmol/L Tris、pH 7.4、137 mmol/L Na⁃Cl、10%glycerol、1%Triton X⁃100、2 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF、10 mmol/L NaF、5 mg/mL抑肽酶、20 mmol/L亮抑酶肽和1 mmol/L原钒酸钠），4℃离心12 000g15 min。用BCA法测定蛋白质浓度。蛋白质样品在用4×SDS上样缓冲液（200 mmol/L Tris、pH 6.8，8%SDS、400 mmol/L DTT、0.4%溴酚蓝、40%甘油）100℃变性5 min，如前所述进行标准SDS⁃PAGE和western blot分析［15］。

1.8 统计学方法 实验数据采用excel进行录入整理，采用SPSS 19.0统计软件包进行分析，对计量资料进行统计描述，两组间比较采用t检验；多组之间比较采用单因素方差分析，对有统计学意义的结果再采用LSD法进行两两比较，以上分析均以α=0.05为检验水准。结果以±s表达。采用Student′st检验进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肝脏中ATF4蛋白呈高表达 为了研究ATF4在小鼠体内的表达情况，我们检测了ATF4在小鼠肝、心、肾、肺组织中的蛋白和mRNA水平。Western blot结果显示小鼠肝脏中有明显的ATF4蛋白表达，而其他组织中几乎检测不到ATF4蛋白表达（图1A）。然而，在上述组织中均能检测到较高水平的ATF4 mRNA（图1B）。

图1 ATF 4蛋白在小鼠肝脏中呈高表达Fig.1 ATF4 proteins are high in mouse liver

2.2 肝脏中ATF4的高蛋白水平与内质网应激或eIF2α无关 鉴于ATF4的蛋白水平受控于eIF2α，我们通过Western blot分析了小鼠组织中eIF2α的磷酸化水平。结果表明，在检测的组织中，磷酸化⁃eIF2α都非常低（图2A），这提示ATF4在肝脏中的蛋白质高水平可能不依赖于eIF2α的磷酸化调控。为了探明小鼠肝脏ATF4蛋白的高表达是否与内质网应激有关，我们使用内质网应激诱导剂衣霉素处理小鼠。如图2B所示，衣霉素处理导致了XBP1 mRNA剪接，提示诱导了内质网应激反应。其次，我们检测了衣霉素处理后小鼠肝脏和肺组织中的eIF2α/ATF4信号。结果表明，衣霉素能诱导小鼠肺组织中eIF2α磷酸化、ATF4和Bip蛋白水平的显著提高（图2C）。在肝组织中，应用衣霉素后，eIF2α磷酸化和Bip表达相应增强，但是，衣霉素处理后ATF4蛋白却呈时间依赖性下降（图2C）。这些结果提示肝脏ATF4蛋白的高水平与eIF2α和内质网应激无关。

图2 肝脏中ATF4蛋白的高表达不受内质网应激或eIF2α调控Fig.2 Liver ATF4 proteins are not upregulated by ER stress or eIF2α

2.3 CCl4和LPS/D⁃GalN诱导的小鼠肝损伤中ATF4蛋白质水平降低 由于ATF4蛋白在小鼠肝脏中表现出较高的表达水平，且不受经典信号调控。本研究进一步探讨了ATF4在肝损伤中的作用。本研究采用CCl4建立慢性肝损伤模型，LPS/D⁃GalN建立急性肝损伤小鼠模型。Western blot分析表明，在CCl4模型中，小鼠肝脏ATF4蛋白表达显著下降，然而ATF4的mRNA水平无明显变化（图3A、B）。见表1。

表1 CCl4组和对照组肝组织中ATF4 mRNA的表达比较Tab.1 Comparison of ATF4 mRNA expression in liver tissues of CCl4 group and control group

此外，LPS/D⁃GalN处理6 h后ATF4蛋白也明显下降（图3C），而ATF4的mRNA也无明显变化（图3D）。见表2。这些结果表明，慢性和急性肝损伤诱导ATF4蛋白质降低。

图3 肝脏ATF4蛋白在肝损伤中降低额度Fig.3 Liver ATF4 proteins were decreased in liver injury

表2 LPS/D⁃GalN组和对照组肝组织中ATF4 mRNA的表达比较Tab.2 Comparison of ATF4 mRNA expression in LPS/D⁃GalN group and control group

2.4 抑制ATF4加剧了CCl4和LPS/D⁃GalN诱发的肝损伤 为进一步探讨ATF4对肝脏损伤的影响，我们建立了ATF4靶向的CRISPR⁃Cas9质粒（ATF4⁃cri），并经尾静脉注射达到下调ATF4在肝脏中的表达。如图4A和B中所示，ATF4⁃cri质粒有效地降低了肝脏ATF4的mRNA和蛋白水平的表达。在注射ATF4⁃cri质粒或对照质粒后，使用CCl4或LPS/D⁃GalN处理小鼠。血清转氨酶分析显示，ATF4⁃cri抑制ATF4后，CCl4肝损伤模型中AST和ALT明显升高（图4B）。在LPS/D⁃GalN模型中获得了相似的结果（图4C）。这些数据提示ATF4的下调使小鼠对CCl4和LPS/D⁃GalN诱导的肝损伤更加敏感，因而ATF4对肝损伤有重要保护作用，见表3、表4。

图4 ATF4抑制促进了CCl4和LPS/D⁃GalN诱导的肝损伤Fig.4 Suppression of ATF4 promoted CCl4 and LPS/D⁃GalN induced liver injury

3 讨论

本研究揭示了小鼠体内ATF4蛋白质和mRNA水平表达模式的特征，首次报道在正常情况下小鼠肝脏中ATF4蛋白保持较高的水平。由于检测的各组织中ATF4 mRNA水平无差异，故认为在组织中ATF4蛋白的差异表达应该是在翻译水平或蛋白稳定水平。众所周知，ATF4蛋白通常在应激条件下被上调，并在应激反应中起着至关重要的作用。多种细胞内应激途径，包括内质网应激，氨基酸不足和氧化应激都可以诱导eIF2α的磷酸化，这导致了蛋白质合成的普遍抑制，而ATF4 mRNA翻译反而上调［3］。本研究观察到ATF4蛋白在小鼠肝脏中呈高水平，而在其他组织中却几乎检测不到。然而在检查的组织中eIF2α磷酸化水平均呈现一致的低水平，这与肝脏中ATF4蛋白的高水平不一致。故认为肝脏ATF4蛋白高水平与eIF2α无关。为了证实这一推测，我们使用内质网应激诱导剂衣霉素来触发内质网应激和eIF2α磷酸化。衣霉素在小鼠肝脏和肺脏诱导的内质网应激通过剪接的XBP1 mRNA、Bip蛋白的增加和eIF2α磷酸化得到了证实。小鼠肺脏中被衣霉素持续诱导的ATF4蛋白提示肺脏中ATF4受到eIF2α的经典调节。然而，在衣霉素处理后，肝脏中ATF4蛋白下降，这表明ATF4蛋白在肝组织中有一种与eIF2α无关的特殊调节模式。另一个可能的机制是ATF4的稳定性在肝脏和其他组织中是不同的。据报道，ATF4的降解是由E3泛素连接SCFβTrCP介导的。另有报告表明，P300调节了ATF4的稳定性及其转录活性。ATF4的稳定性是否会导致组织中ATF4蛋白水平的差异需要进一步的研究。

表3 ATF4对CCl4诱发的肝损伤（ALT，AST）的影响Tab.3 Effects of ATF4 on liver injury（ALT,AST）induced by CCl4±s

表3 ATF4对CCl4诱发的肝损伤（ALT，AST）的影响Tab.3 Effects of ATF4 on liver injury（ALT,AST）induced by CCl4±s

注：a表示与空白对照组比较差异有统计学意义；b表示与ATF4⁃cri对照组比较差异有统计学意义；c表示与CCl4组比较差异有统计学意义；d表示与ATF4⁃cri+CCl4组比较差异有统计学意义

组别空白对照组ATF4⁃cri对照组CCl4组ATF4⁃cri+CCl4组F值P值ALT 53.2±11.8cd 91.2±58.0cd 2 602.3±1103.7abd 4 358.6±2192.0abc 17.469＜0.001 AST 254.8±110.0cd 195.7±49.4cd 1 245.8±672.9abd 2 516.4±672.9abc 13.264＜0.001

表4 ATF4对LPS/D⁃GalN诱发的肝损伤（ALT，AST）的影响Tab.4 Effects of ATF4 on liver injury（ALT,AST）induced by LPS/D⁃GalN ± s

表4 ATF4对LPS/D⁃GalN诱发的肝损伤（ALT，AST）的影响Tab.4 Effects of ATF4 on liver injury（ALT,AST）induced by LPS/D⁃GalN ± s

注：a表示与空白对照组比较差异有统计学意义；b表示与ATF4⁃cri对照组比较差异有统计学意义；c表示与LPS组比较差异有统计学意义；d表示与ATF4⁃cri+LPS组比较差异有统计学意义

组别空白对照组ATF4⁃cri对照组LPS组ATF4⁃cri+LPS 组F值P值ALT 102.7±22.32cd 124.83±14.6cd 2451.0±846.5abd 7777.8±3587.0abc 23.083＜0.001 AST 57.7±21.8cd 71.3±20.9cd 3081.7±1193.3abd 13948.2±4160.7abc 55.699＜0.001

本研究的目的是探索小鼠肝脏中ATF4蛋白表达的高水平是否暗示其在肝脏中的重要作用。据报道［17］，ATF4突变可导致严重的胎儿贫血和胎儿肝脏发育不全。另外有报道表明ATF4在肝脏脂质代谢中起着重要的作用［8-11］。肝损伤是导致侵袭性肝脏疾病最常见的肝损害。本研究中，我们采用CCl4介导的慢性肝损伤模型和LPS/D⁃GalN诱导的急性肝损伤模型，探讨了ATF4在肝损伤中的作用。有趣的是，我们发现在使用CCl4和LPS/D⁃GalN后，小鼠肝脏中的ATF4蛋白明显降低，而mRNA无明显变化。现在的问题是，ATF4的降低在肝脏损伤中是否发挥了作用。本实验结果表明，Crisper对ATF4的敲低作用明显加重了CCl4和LPS/D⁃GalN所致的肝损伤，表现为血清AST和ALT进一步升高。这些结果提示ATF4在肝损伤中具有保护作用。在以往的研究中，ATF4被认为是正常细胞增殖的关键，尤其是对于胎肝造血时期所需的高水平增殖［17］。肝脏是一个再生能力极强的组织，肝细胞能够在肝脏损伤反应中增殖，以恢复其功能。在使用CCl4和LPS/D⁃GalN处理后的模型中，需要高水平的细胞增殖协助肝脏功能的恢复。因此，我们的结果的一个可能的解释是ATF4的缺乏抑制了肝修复反应中的细胞代偿增殖，从而导致了更严重的肝损伤。ATF4的下调促进肝损伤的详细机制有待进一步研究阐明。

总之，本研究揭示了ATF4蛋白在小鼠肝脏中的表达不依赖于经典调控模式。化学剂诱导的肝损伤可引起肝脏中ATF4蛋白的下调，ATF4的下调促进了CCl4和LPS/D⁃GalN诱导的肝损伤。