痰热清注射液对AECOPD患者外周血单核细胞TLRs/NF-κB信号通路及下游细胞因子的影响*

刘 锐 叶传冬 雷宁宁 何 嘉 侯体保 刘秀芳

（1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；2.广西中医药大学，广西 南宁530001）

在慢性阻塞性肺疾病（COPD）发病过程中，出现超出日常状况，需要改变COPD日常基础用药的情况称慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）[1]。 AECOPD在中医学中属“咳嗽”“喘证”“肺胀”等范畴，临床多以清热化痰、行气活血、宣降肺气为治则[2]。不少研究发现[3-7]，痰热清注射液清热、解毒、化痰的作用机制可能与降低血清细胞炎症因子白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等水平有关。本次临床研究在已有研究明确痰热清注射液治疗AECOPD有效的基础上，拟对该药抗炎相关作用机制进行探索，为该药物的临床运用提供更可靠的实验依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择 1）诊断标准：痰热郁肺证候辨证标准参照《中医内科学》[8]，症见咳逆喘息气粗，痰黄或白，黏稠难咯，胸满烦躁，或发热汗出，口渴欲饮，舌质暗红，苔黄或黄腻，脉滑数。西医诊断标准参照2016版GOLD[9]以及 2013 年《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》[10]。40岁以上患者若符合下列指标，应考虑为COPD。（1）慢性咳嗽，可为间歇性咳嗽，伴或不伴有咯痰表现，发作性喘息；（2）慢性咳痰，任何形式的慢性咳痰可能提示COPD；（3）呼吸困难，随时间进行性加重，特征性表现为活动后加重，持续存在；（4）反复下呼吸道感染；（5）危险因素，宿主因素（如遗传因素、先天发育异常等）、吸烟（包括当地流行的烟草制品）、家庭烹调和取暖燃料产生的烟雾、职业粉尘、蒸汽、烟雾、气体，以及其他化学物质；（6）COPD家族史和/或幼年因素，例如出生低体质量、幼年反复呼吸道感染等；（7）支气管扩张剂后FEV1/FVC＜70%，可确定存在持续气流受限。如果有相应的症状和明显的危险因素接触，则可诊断慢阻肺；（8）AECOPD[2]，短期内出现呼吸和全身状况恶化，患者通常会有全身炎症反应，肺动脉高压，甚至呼吸衰竭。2）纳入标准：确诊为AECOPD同时符合中医辨证为痰热郁肺型患者，年龄40～80岁，经医院伦理委员会同意且患者签署知情同意书，并愿意接受医生治疗、完成全程治疗者。3）排除标准：对本药过敏者。具有严重心力衰竭（心功能Ⅳ级），合并肝、肾、造血系统等严重原发疾病、精神病患者，合并肺结核、真菌、肿瘤等肺原发病，肺性脑病患者。合并肺栓塞、气胸、胸腔积液者。

1.2 临床资料 选取2016年12月至2017年12月广西中医药大学附属瑞康医院呼吸内科、老年病科AECOPD住院患者60例，按照随机、对照原则，采用区组随机化方法分为对照组与治疗组各30例。对照组男性20例，女性10例；年龄51～79岁，平均 （73.20±5.19）岁；中医证候评分（9.40±1.10）分；病程 5～30 年，平均（10.40±4.64）年。治疗组男性22例，女性8例；年龄 49～80 岁，平均（72.60±5.67）岁；中医证候评分（9.20±1.35）分；病程 7～28 年，平均（12.01±7.40）年。两组资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.3 治疗方法 对照组入院后给予常规改善通气、解痉平喘、止咳化痰并根据病原学及药敏试验予抗感染等治疗。治疗组在常规治疗上另给予中成药痰热清注射液（上海凯宝药业有限公司生产，国药准字Z20030054）20 mL，用250 mL 5%葡萄糖注射液或者0.9%氯化钠注射液稀释后静脉滴注，每日1次，10 d为1个疗程。

1.4 观察指标 1）细胞因子：两组患者分别于入院第1、11日清晨抽取静脉血5 mL，离心分离血清，-80℃保存，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测 TNF-α、IL-8、IL-17（武汉华联科生物技术有限公司试剂盒），核因子NF-κB（美国 Active Motif公司试剂盒），具体操作见试剂说明书。2）分离外周血单核细胞及检测单核细胞膜表面TLR4蛋白表达：两组患者分别于入院第1、11日清晨抽取静脉血2 mL，用肝素钠抗凝，用红细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司）分离外周血单个核细胞两次，4℃ 1500 r/min离心10 min，弃上清液，加入pH 7.45 PBS，1500 r/min 离心 10 min， 取 100 μL 加 入CD14-FITC抗体和TLR4-PE抗体（美国BD公司），避光4℃下孵育30 min，后4℃ 1500 r/min离心4 min，弃上清液，加PBS 400 μL，重悬过滤至流式试管中，放在FACSCalibur型流式细胞仪上测定106/100 μL外周血单核细胞中TLR4 PE-H阳性百分率。

1.5 中医疗效标准 根据《中药新药临床研究指导原则》[11]，病情积分标准按等级记分。 发热：0、1、2、3 级，计 0、2、3、4 分。痰的色、质、量：0、1、2、3 级，计 0、2、3、4分。 咳嗽：0、1、2、3 级，计 0、2、3、4 分。 气喘：0、1、2 级，计 0、1、2 分。口干：0、1、2、3 级，计 0、1、2、3 分。肺部啰音：0、1、2、3 级，计 0、1、2、3 分。 疗效分为临床控制、显效、有效、无效4级。临床控制：主要症状、体征完全或基本缓解，客观指标恢复正常，治疗后总积分减少≥90%，即（治疗前积分-治疗后积分）/治疗前积分×100%≥90%。显效：主要症状、体征明显缓解，客观指标接近正常，治疗后总积分减少≥70%。有效：主要症状、体征好转，客观指标有所改善，治疗后总积分减少≥30%。无效：主要症状、体征无变化，客观指标变化不明显或加重，治疗后总积分减少＜30%。

1.6 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件。符合正态分布的计量资料数据以（±s）表示。计数资料百分率（%）表示，应用χ2检验。正态分布样本组间比较采用两独立样本t检验，多次比较采用重复测量方差分析。非正态分布组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组临床疗效比较 见表1。治疗组总有效率高于对照组（P＜0.05）。

表1 两组临床疗效比较（n）

2.2 两组治疗前后血清 IL-8、IL-17、TNF-α、NF-κB水平比较 见表2。两组治疗前TNF-α、IL-8、IL-17比较，差异均不大（均P＞0.05）。两组治疗后TNF-α、IL-8、IL-17较本组治疗前降低（均P＜0.05），且治疗组下降幅度均大于对照组（均P＜0.05）。

表2 两组治疗前后血清TNF-α、IL-8、IL-17、NF-κB水平比较（分，±s）

表2 两组治疗前后血清TNF-α、IL-8、IL-17、NF-κB水平比较（分，±s）

与本组入院第1天比较，*P＜0.05；与对照组治疗第11天比较，△P＜0.05。下同

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2.3 两组外周血单核细胞中TLR4阳性百分率比较见表3，图1、图2。两组治疗前TLR4阳性百分率比较，差别不大（P＞0.05）。两组治疗后TLR4阳性百分率较本组治疗前下降（P＜0.05），且治疗组下降幅度大于对照组（P＜0.05）。

表3 两组外周血单核细胞TLR4阳性百分率比较（%，±s）

表3 两组外周血单核细胞TLR4阳性百分率比较（%，±s）

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图1 两组入院第1天TLR4阳性百分率情况

图2 两组入院第11天TLR4阳性百分率情况

3 讨 论

COPD根据其咳嗽、咯痰、气喘等症状归属于中医学“肺胀”范畴，中医学对于COPD病因病机的研究颇多。认为其发生多由久病肺虚、感受外邪及年老体虚所导致。肺胀的基本病机总属本虚标实，肺、肾、心、脾脏器亏虚为本，痰浊、水饮、血瘀互结为标，二者彼此影响，互为因果，复为外邪所诱发，而致气道壅塞，肺气胀满，不能敛降，发为肺胀[12]。《医学三字经》言“然肺为气之主，诸气上逆则呛而咳，是咳嗽不止于肺，而亦不离乎肺也”[13]。关于COPD的发病机理也各有论述，如水饮客肺，《内经素问·逆调论》云“不得卧，卧则喘者，是水气之客也”[14]；外邪客肺，巢元方提出“肺主于气……为息奔上气”[15]。肺胀与中气，《柳选四家医案》记载“咳而吐沫……中气伤矣”[16]。可以看出，肺胀的发生，多因久病肺虚，痰浊潴留而致肺不敛降，气还肺间，肺气胀满，每因复感外邪诱使病情发作或加剧。

痰热清注射液由多味中草药采用先进的配制技术制成，组方具体包括黄芩、连翘、熊胆粉、金银花、山羊角。配伍中黄芩为君药，具有抗炎、抗变态反应作用，Fan等研究发现，黄芩提取物可能参与抑制脂多糖诱导的细胞下游炎症因子的合成与释放[17]。熊胆粉、山羊角为臣药，具有缓解痉挛、消除炎症、抗惊厥等作用，郑亿等研究发现，熊胆粉对小鼠体内体外大肠埃希菌等多种细菌具有明显的抑制作用[18]。现代药理研究发现山羊角提取物对伤寒等病毒所致发热的兔具有明显解热作用；金银花与连翘配伍能够抑制和杀灭多种病原微生物，《本草纲目》记载金银花具有“久服轻身、延年益寿”之功，为“疮家圣药”。

TLR4是人类发现的第一个TLR相关蛋白，几乎分布于所有的细胞系，主要表达在参与宿主防御功能的细胞，以骨髓单核细胞的表达最多[19]，其主要介导革兰氏阴性菌表面的脂多糖（LPS）的信号转导，并通过其信号途径激活 NF-κB， 启动 TNF-α、IL-8、IL-17的转录翻译，激发炎症因子的瀑布效应[20]。如今关于TLRs参与天然免疫的的研究已达到一个新的水平，对TLRs传导通路的深入研究可以更科学的了解机体天然免疫中的分子机制。但目前对于COPD发病机制中关于TLRs的研究多停留在动物模型水平，本研究旨在研究TLRs表达在COPD患者气道炎症过程的具体作用。

本研究以TLR4/NF-κB信号通路为靶点，观察到使用痰热清注射液治疗后TNF-α、IL-8、IL-17均明显降低，抑制炎症因子表达。进一步观察到治疗后TLR4、NF-κB表达下调，表明痰热清注射液能够直接抑制单核细胞TLR4蛋白表达，进而抑制NF-κB活化，调控炎症因子 TNF-α、IL-8、IL-17 转录。

综上所述，在常规治疗基础上加用痰热清注射液可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活减轻AECOPD患者炎症反应，本研究体现了中西医联合治疗AECOPD的优势，为痰热清注射液治疗AECOPD提供了理论和试验依据，值得临床推广使用。