双抗体夹心ELISA法测定食物中虾过敏原成分

□ 李晓燕 张树华 侯国强 张春涛 潍坊工商职业学院

近年来，食物过敏症受到人们的关注，尤其是虾等甲壳类动物以及其制品均会引起食物过敏的现象，其过敏表现主要为荨麻疹、风疹、哮喘等，严重的甚至会对生命安全造成威胁。本文探究如何利用双抗体夹心ELISA法检测虾过敏原成分。

1 材料和方法

1.1 材料

本次实验中选取了来自某动物学院中心的4周龄小鼠和30例2017年2月至2018年2月到某医院就诊的尘螨皮试呈阳性的患者。收集患者血清进行，制备血清池，购买新鲜的虾。

1.2 方法

在制备与纯化虾过敏原多克隆抗体的过程中，先首次免疫，取经过纯化的抗原蛋白10 μg和等量的弗氏完全佐剂，混合乳化后，皮下注射到小鼠的颈部和背部。第2次加强免疫时，取与之前等量的抗原蛋白，再加入等量的不完全佐剂，免疫之间要相隔3周，第3次免疫后的第5 d，采集血，并进行离心后将血清分离出，进行抗血清纯化。将纯化好的抗体的原缓冲液用PBS进行替换，然后按照一定的比例将抗体和生物素混合，放置在避光处，一段时间后，按照说明书回收膜柱。

虾过敏原多克隆抗体制备完成后，利用双抗体夹心ELISA法测定虾过敏原，先采用吸附法包被虾过敏原多克隆抗体，在每个孔内加入100 μL包被缓冲液，放置在4 ℃的环境下过夜后将包被液倒掉，再采用同样的方法加入200 μL的封闭液，搁置在37 ℃下振荡2 h，将封闭液倒掉。在粗虾提取时，要按照比例稀释，每个孔内加入100 μL后，与PBS进行阴性对照。在37 ℃下振荡1 h，然后用PBST清洗3遍。在对生物素标记的抗虾过敏原多克隆抗体稀释时，按照1∶500的比例在每个孔内加入100 μL的稀释液，在37 ℃下振荡1 h，然后用PBST清洗3遍。以1∶500的比例将HRB-链酶亲和素进行稀释，在每个孔内加入100 μL的稀释液，在37 ℃下振荡1 h，然后用PBST清洗3遍。将底物液加入，在37 ℃的环境下振荡10 min，读数并做好记录[1]。

2 测定结果

2.1 鉴定抗虾过敏原的抗体

虾过敏原抗体能够对71、36、23、19等组分进行识别，因此，可判定此抗体能够对虾主要过敏原蛋白的组分36 Ku进行识别。

2.2 对间接ELISA检测鼠虾过敏原蛋白多克隆抗体的IgG效价

鼠虾过敏原蛋白多克隆抗体的IgG效价的滴度曲线，如图1所示。

图1 鼠虾过敏原蛋白多克隆抗体的IgG效价的滴度曲线

图2 双抗体夹心ELISA法测定食物中虾过敏原成分的曲线

由图1可知，阴性组抗体的滴度随着吸光度的增加而下降，将阳性孔与阴性孔的比值大于2.1定位测量标准，此时测得免疫血清的效价为1:204 800。

2.3 双抗体夹心ELISA法测定虾成分过敏原成分的曲线

对标准的虾总蛋白提取液进行稀释，测定双抗体夹心ELISA法的检出限（如图2所示）。吸光值随着抗原浓度的降低而下降，以测定孔与阴性孔比值大于2.1为标准，得出虾蛋白的检出最低限为40 ng/mL，并且标准曲线在40～1 000 ng/mL之间的线性良好。

3 讨论

相关研究显示即使是不同品种的虾产品，其过敏原实际上并没有变化。而通过本次研究，可以发现双抗体夹心ELISA法测定食物中虾过敏原成分具有较好的灵敏度和特异性，相比其他方法减少了抗体的用量。

本次研究没有完全测定出食品中虾过敏原含量，这可能是由于区域之间存在着较大的差异，但是为我国食品安全过敏原检测问题提供了技术标准，为更好地管理食品过敏原打好了基础。