浅谈食品中微生物的国家标准检测方法

□ 陈 丹 付伟超 商丘市质量技术检验测试中心

“民以食为天，食以安为先”，随着生活水平的不断提升，人们对于食品的要求也比以前要严格得多，不仅限于以前的能够吃饱饭，怎样能够吃好，吃得有营养成为当今生活的主方向。大家的目光逐渐关注到食品这方面。随着我国食品生产，加工过程和流通过程的快速发展，导致不少黑心商贩开始投机取巧，毒豆芽、红心鸭蛋、“大头娃娃事件”、皮革酸奶等等渐渐出现在大家的生活中。食品安全问题成为大家关注的重大问题。

随着食品发展速度的加快，不仅仅国内食品的流通，不少进口食品深受当今国民的喜爱，很多人开始喜欢海外代购。由于微生物中的致病性细菌可以导致的疾病不断增加，而且食品中的致病性细菌会危害人们的健康，在国外公布的那些微生物污染食品和人类健康的事件在我国依然存在。

食品是否发霉变质直接影响到消费者的身体健康，故食品中菌落总数、霉菌、致病菌的测定是评判产品质量是否合格、是否对人类的健康产生危害的重要指标。本文对食品中经常检测的几项微生物指标的检测方法进行探讨。

1 食品中菌落总数的常规检测方法

菌落总数的检测是食品微生物检测中最常规的检测。食品中菌落总数的多少直接影响食品的货架期，控制好菌落总数的数值在食品品质方面有着重要的作用。当今，菌落总数的检测方法常规有两种，一种是参照GB4789.2-2016的国家标准检测方法，另一种是纸片快速检测方法。

1.1 菌落总数的定义

菌落总数是指食品检验样品按照国家标准的处理办法，在一定温度下，使用一定的培养基，培养一定的时间后，所得每克样品或者是每毫升样品中生长出来的微生物的总称。该项目主要作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可应用菌落总数的检验方法来反映食品在生长储存的状态中微生物繁殖的情况、生长的动态。以反映食品在生产、加工、销售过程中是否符合卫生要求，为被检验样品是否合格，人们是否可以使用提供一定的参考。

1.2 实验的关键因素：无菌意识

在进行食品微生物的各项检测过程中，实验者必须明确一个非常关键的因素——无菌意识。整个实验过程中检测使用的所有东西都必须是无菌的、经过杀毒灭菌的。实验环境所谓的无菌，是指在环境中一切有生命活动的微生物的细胞及其孢子或芽胞都不存在。对实验人员来说，实验用的实验服、帽子、口罩、全部都是杀过菌的，实验人员的手部要进行消毒。实验使用的所有材料和物品包括培养皿、镊子、剪刀、培养基等都是经过高压灭菌后的。无菌意识在整个过程都要严格遵守。

图1 菌落总数操作过程

1.3 实验操作过程

微生物的实验过程，按照GB4789.2-2016的操作过程进行操作。按图1中的过程进行操作。对待做样品要进行连续倍数的样品稀释。制备10倍系列稀释的样品匀液时，每一步都应该摇匀试管或反复吹吸，实验过程中可以使用灭菌后的移液管或者可以灭菌的枪头的移液器，使待测样品中的菌体能够充分分散均匀。

对于一些酸度较高的样品，例如食醋，需要按标准GB/T 4789.22-2003《食品卫生微生物学检验 调味品检验》中的要求先用灭菌的20%～30%碳酸钠溶液将其pH值调至中性后才可以准确检测出菌落总数。不然食品的酸度太高将影响实验的结果，最终的结果有可能直接是0。 pH值的大小一定会影响食品中菌落总数的测定结果，只有做实验时将pH值调至中性，才能准确测定出食品中的菌落总数。通过不少实验证明，pH值在3.8～7.0时，对菌落总数检验的结果会影响小一些，随着pH值的减小，菌落总数就会越来越小。当所检测的pH值结果在2.1前后时，可以对琼脂上的菌落总数起到完全抑制作用。因此，大家在实验中一定要仔细认真，考虑pH值对检验结果的影响，做实验时一定要先调节pH值至中性后，才能检验出菌落总数的真实结果。

1.4 样品从稀释到倾注平板的时间要求

在一般的实验室中，由于每次进行检验的样品数量比较多，实验室工作人员为了可以保证工作效率，保证操作的连续和方便性，实验人员一般都是先将所有待检样品稀释好后，再依次倾注平板，如此操作就导致一个样品由开始稀释到倾注平板的总时间通常要一个小时以上。经过多次实验发现，实验的样品样从稀释到倾注平板的时间间隔越长，测出来的结果会越多。菌落总数的生长速度跟时间呈正比增长的关系，短短的十几分钟对于呈对数生长的细菌来说有可能已经生了很多代。因此，样品从处理稀释样品开始到倾注平板的时间最好不要超过20 min。

1.5 培养基温度要求

样品稀释后，做出合理的稀释倍数后，接着进行倒平板。倒平板所用的培养基都是灭菌后冷却至46 ℃左右的培养基。倒平板所使用的培养基温度过高可能会杀灭部分不耐热的细菌，也会使冷凝水过多，滴落在培养基表面，使生长在平板底部的细菌蔓延生长，影响菌落总数的计数。培养基的温度太低时，琼脂容易凝固，使得培养基无法与稀释液充分混匀，菌落无法均匀生长，也会影响菌落计数。倒好培养基后，沿一个方向进行摇晃直到稀释样品与培养基混合均匀。将平板倒置存放于36 ℃的培养箱中48 h。

2 食品中霉菌计数的常规检测方法

霉菌是丝状真菌的通称。霉菌广泛存在于自然界中，因为霉菌会形成各种各样微小的孢子，孢子通过各种传播途径很容易污染食品。当温度和湿度适合霉菌生长时，会非常迅速地形成分枝繁茂的菌丝体，但又不像蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。温度对霉菌的繁殖及产毒均有重要的影响，不同种类的霉菌其最适温度是不一样的，很多霉菌繁殖最适宜的温度为24～30 ℃。由于霉菌的生长繁殖周期短，生长极为迅速，非常容易造成食品的发霉腐烂，最后变质。发霉的花生、发霉的玉米和小麦中的黄曲霉毒素非常高，人类误食了发霉的食品会引起身体的癌变。自从20世纪六七十年代发现强致癌的黄曲霉毒素以来，霉菌与霉菌毒素对食品的污染引起了人们的重视。我国制定了 GB2761-2017《食品中真菌毒素限量》标准 、GB4789.15-2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》，各个食品检测机构都全面开展霉菌的检测工作。

2.1 霉菌的培养方式

有关霉菌的检验方法跟前面所述的菌落总数的检测方法的注意事项相似。2017年4月19日，有关霉菌检测的国家标准改变了，GB4789.15-2016跟GB 4789.15-2010的最大改变就是5.2中的培养中平板的培养方式。2010版的标准中霉菌平板的是待琼脂凝固后，将平板倒置，（28±1）℃培养5 d，观察并记录；2016版的标准中霉菌平板的是待琼脂凝固后，正置平板，（28±1）℃培养5 d，观察并记录。通过半年来的实验证明，倒置平板的培养方式出来的结果比较准确。正置平板培养过程中，培养箱中的温度不断升高，致使底部的培养基中的水分蒸发，遇到培养皿的上部，水分会汇集在一起,集聚到一定的大小时，会滴落到下层的培养基上，造成下部霉菌数的不准确。另有些霉菌会长孢子，早期生长出的霉菌孢子就会在培养基内扩散，形成新的菌落，导致结果不准确。所以，笔者认为霉菌的培养方式还是应该采用倒置培养，这样结果更接近于产品的自身结果。

2.2 解决霉菌偏差的方法

对于每次实验中结果的偏差，实验室可以让不同的实验人员按照国家标准的规定进行实验，实验样品应选取均匀且霉菌数均可以通过实验测得的测试样品。对于同一个样品，实验人员应该做多次的平行实验，来确定最终的霉菌数量。

2.3 实验注意事项

按照国家标准的检测方法霉菌检测时间长，所以在实验过程中实验人员有必要进行多次观察。实验人员应该在实验前做好实验计划，确定观察记录的时间。一般情况下在培养 24 h后就应该进行观察，对于那些生长迅速的，菌丝很长的一类霉菌 48 h 后就可计数。 在实验过程中实验人员可以在操作工作台上放置两个倒好培养基的，待接种结束后，与同批次进行的霉菌进行一起培养，来对整个实验过程进行验证，可以发现在整个实验过程中是否受环境污染。检验前后都应认真做好全面的消毒灭菌工作。霉菌计数结束后应第一时间将有霉菌的培养物高压灭菌,以防进一步污染。

3 结语

微生物检测的误差除了培养基和检测环境之外，还来自于实验样品和检验的操作过程和实验的准备环节。通常情况下食品微生物样品的检测不能复检。但如果当菌落总数在此样品所执行标准的临界值或者菌落结果出现明显的异常时，也是有必要进行复检的。可以重新检测储存条件跟之前相符的同一生产批次的样品。食品微生物检测的准确性，必须贯穿在整个实验过程。只有严格控制，才能控制好食品的安全性，才能保证国民的安全！