冷应激对雏鹌鹑胸腺组织超微结构的影响

刘春朋，付 晶*

（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广州 510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广州 510225）

在畜牧业养殖生产过程中，除了营养、遗传因素之外，环境也是一个重要的因素。动物在饲养过程中，经常遭受各种环境应激源的影响，如温度应激（冷、热）、光照应激、有害气体应激（硫化氢、氨气）、粉尘应激以及运输应激等，其中温度应激比较普遍[1]。如果这些应激得不到及时治理，将会直接影响到畜禽的健康以及畜产品品质，进而危害人类健康。寒冷是北方地区畜牧生产所面临的普遍应激源。冷应激可引起畜禽尤其是幼畜或新生仔畜的神经内分泌系统紊乱、免疫机能下降、腹泻、生产性能下降甚至死亡[2]。鹌鹑是一种高产高效的特禽，其生物学特性比较特殊，鹌鹑在饲养过程中对环境温度的要求是相对较高的，尤其是育雏期的温度比鸡还要高，因此更容易受到冷应激的影响[3]。

胸腺是禽类免疫系统中重要的淋巴器官，其参与细胞免疫的过程，是T细胞分化、发育、产生的场所，在整个免疫系统中起着中枢作用，其损伤必将导致免疫功能障碍进而引发一系列疾病。有研究表明，当鸡受到热应激后，免疫器官有明显损伤，尤其是胸腺组织会发生萎缩性变化，机体免疫功能下降[4]。而目前关于冷应激对雏鹌鹑胸腺组织形态结构的影响研究较少。因此，本试验以1日龄雏鹌鹑为研究对象，通过对雏鹌鹑胸腺组织病理组织学观察，探讨冷应激导致禽类免疫功能下降的作用机制，以期为更好地研究鹌鹑内环境打下基础，也为探索促进禽类冷适应的方法、提高禽类的抗寒能力提供理论依据。

1 试验材料

1.1 试验动物

1日龄健康沙维玛特肉用公鹌鹑360只，购自哈尔滨万家特禽养殖合作社。

1.2 主要试剂

磷酸戊二醛、乙醇、丙酮、四氧化锇等常规试剂均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 主要仪器

Phenix/凤凰电子显微镜（型号为PH100-DB500 U-IPL），购自凤凰光学集团有限公司；日立高新透射电镜（型号为HT7700），购自天美（中国）科学仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 冷应激模型的建立

2.1.1 急性冷应激

试验将1日龄沙威玛特肉用鹌鹑180只饲养至15日龄，随机分为6组，每组30只。对照组冷应激0 h（即放在鹌鹑正常育雏期所需温度34±1℃的舍内饲养），其余5组分别进行冷应激处理，即把鹌鹑置于（12±1）℃的舍内饲养，饲养时间分别为0.5、1、3、6和12 h。在各时间随机选取10只进行剖杀，并采集胸腺组织。

2.1.2 慢性冷应激

试验将1日龄沙威玛特肉用鹌鹑180只饲养至15日龄，随机分为6组，每组30只。前3组为对照组，即正常温度下分别饲养5、10和20 d后剖杀；其余3组为应激组，分别于（12±1）℃冷应激环境下饲养5、10和20 d后剖杀取样。

整个试验过程中，各组雏鹌鹑均自由饮水和采食，并按常规免疫程序进行免疫。

2.2 胸腺组织超微结构的观察

鹌鹑剖杀时迅速在每只鹌鹑中采集3份1 mm3大小的胸腺组织样品，并固定于浓度为2.5%的戊二醛磷酸盐缓冲液（pH为7.2）中＞4 h。然后根据廖望的试验方法，将固定好的样品用PBS漂洗3次，15 min·次-1；之后使用2%锇酸固定2 h，再用PBS漂洗3次，再依次进行脱水、置换、浸透、包埋、聚合、切片、染色等过程[5]。最后在透射电镜下进行超微结构的观察。

3 结果与分析

3.1 急性冷应激时胸腺组织超微结构的变化

急性冷应激时胸腺组织的超微结构变化见图1。

图1 急性冷应激时胸腺组织的超微结构变化

急性冷应激时，对照组细胞结构规则，排列紧密，细胞核成卵圆形，清晰可见，线粒体嵴排列整齐，内外膜结构清晰，无肿胀肥大现象，内质网及高尔基体形态规则，无扩张（见图1A）；急性冷应激0.5 h时，线粒体出现轻微的嵴断裂，核仁大多瓦解消失（见图1B）；急性冷应激1h时，线粒体出现较严重的空泡化，细胞间隙增宽（见图1C）；急性冷应激3 h时，细胞核轻微变形，细胞数量减少，细胞间隙增大（见图1D）；急性冷应激6 h时，个别细胞出现凋亡现象（见图1E）；急性冷应激12 h时，细胞核破裂，变大或者消失，发生细胞凋亡（见图1F）。

3.2 慢性冷应激时法氏囊组织超微结构的变化

慢性冷应激时胸腺组织的超微结构变化见图2。慢性冷应激时，5 d的对照组胸腺组织超微结构显示为：细胞结构规则，排列紧密，细胞核成卵圆形，清晰可见，线粒体嵴排列整齐，内外膜结构清晰（见图2A）；冷应激5 d时，嵴数量减少，内质网扩增，部分内质网有包被受损线粒体的趋势（见图2B）；冷应激10 d时，细胞排列松散，细胞核轻微变形染色质结块，部分边聚，并出现内质网包被线粒体（见图2C，2D）；冷应激20 d时，线粒体空泡，内质网增多，染色质结块，出现细胞凋亡和自噬溶酶体（见图2E，2F）。

图2 慢性冷应激时胸腺组织的超微结构变化

4 讨论

胸腺参与机体的细胞免疫，胸腺的发育状态和机能的强弱将直接影响着自身免疫水平。应激可以导致畜禽机体免疫机能下降、生产性能下降、诱发疾病甚至死亡[6]。研究结果表明，冷应激引起的机体免疫力下降涉及体液免疫、细胞免疫以及肠道黏膜免疫[7-9]。由于研究者所使用的实验动物存在种属差异且应激的强度及持续时间也不相同。因此，目前关于冷应激对畜禽免疫损伤的机制并不十分清楚。细胞凋亡是由多基因控制的细胞主动死亡的过程，是程序性细胞坏死的主要形式[10]。关于热应激能够导致畜禽免疫器官发生形态学损伤和细胞凋亡的研究已有报道。唐嘉等研究表明，在热应激下对鸡的胸腺体积、胸腺小叶、皮髓质等进行观察得出胸腺与对照组相比体积、胸腺小叶的数量、胸腺小体的个数、皮髓质的比例均减小，出现胸腺萎缩，而这种萎缩与细胞凋亡有关[11]。此外，热应激下鸡胸腺组织遭受到较大损害，出现严重的空泡化现象，滤泡间隙增大，结缔组织出现增生[12]。

试验通过对雏鹌鹑胸腺组织超微结构的观察，发现冷应激能够导致胸腺组织细胞器受损，发生细胞凋亡，且随应激时间的延长凋亡细胞数量增多，慢性冷应激的凋亡程度重于急性冷应激，这与前人的研究结果基本一致。这可能是冷应激造成机体免疫损伤的一个途径。在以后的研究中，可以从细胞凋亡通路进一步探讨冷应激致雏鹌鹑免疫器官损伤的机制。