不同季节绿茶香气成分的判别与聚类分析

KANG Suyoung，朱 荫，郑新强，梁月荣,*，林 智,*

（1.中国农业科学院茶叶研究所，农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江 杭州 310008；2.浙江大学茶叶研究所，浙江 杭州 310058）

茶叶香气是影响茶叶品质好坏和消费者选择的重要因素之一。茶叶香气的形成主要受茶树品种、栽培环境、采摘季节、加工工艺等因素影响，促使茶叶香气物质的组成和含量存在差异，从而产生不同类型的香气品质[1-2]。根据生产季节的不同，茶叶有春茶、夏茶和秋茶之分，不同季节的茶叶香气品质受气候条件如光照、温湿度、光质、雨量等影响，制成的茶叶香气有所区别。一般而言，春茶香气最高，秋茶次之，夏茶香气最低[3]。张正竹等[4]研究表明春、秋季的香气前体总量高于夏季，香气前体种类则随季节变化的消长规律也存在明显差异。赖幸菲等[5]将不同季节翠玉品种加工的绿茶香气进行对比研究发现，春茶和夏茶的香气物质种类较多，物质组成较为相似，且春茶主导香气成分多呈现为花香型；秋茶的香气物质种类较少，主导香气成分与春、夏两季不同。由此可见，生产季节对茶叶香气品质的形成起着至关重要的作用，查明不同季节间茶叶的关键差异性香气成分有助于进一步丰富茶叶香气化学理论，更可为绿茶香气的形成机理研究及科学评价提供理论参考依据。

本研究旨在查明不同季节绿茶样品间的关键差异性成分，因此在茶树的产区及品种选取上需具有较强的广泛性及针对性。中国茶叶主要分布在西南、华南、江南及江北4 个产区，其中西南产区是中国最古老的茶区，而江南产区为中国茶叶主要产区，年产量大约占全国茶叶总产量的2/3，产区内茶叶具有较强的代表性[6]。两大产区的四季均较为分明，受茶树生长的气候、湿度、水分及温度等生态因素影响大，其成品茶在挥发物质组成上也会表现出显著性差异。因此在本研究中拟采用来自重庆永川、贵州铜仁（西南产区）及安徽安庆（江南产区）的代表性茶树品种（碧香早、福鼎大白茶、迎霜、皖茶91和舒茶早）作为研究对象。在品种选择上，所选取的茶树品种具有较强代表性及地域特色，如福鼎大白茶、迎霜为国家级无性系茶树品种，由于抗逆性强，耐旱耐寒，因此被广泛种植于多个产区；而皖茶91和舒茶早则是安徽地区较为知名的两个国家级茶树品种，具有较强的地域特点及代表性[7]。

另一方面，顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）法是利用萃取纤维的选择性吸附特性对所需检测成分进行微量萃取的一种方法，可用于收集干茶和茶汤的挥发性化合物[8-9]。HS-SPME的优点在于集采样、萃取、浓缩为一体，与气相或液相色谱等仪器联用能简便、快捷地分析样品，而无需有机溶剂、成本低[10-11]。因此，该方法在近年来被广泛运用于茶叶的香气成分定性定量分析上[12-13]。偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminate analysis，PLS-DA）在茶叶种类判别及品质评价等方面已有较好的应用[14-16]。叶能胜等[17]采用胶束电动色谱荧光诱导法结合PLS-DA技术将3 种不同绿茶正确区分。本课题组曾采用HS-SPME/气相色谱-火焰离子检测器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）及HS-SPME结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术对茶叶中常见的12 种挥发性萜类化合物的对映异构体进行分析[18-20]，结合PLS-DA技术将大叶种及小叶种红茶区分，并采用该技术使绿茶、白茶及黑茶分别获得良好的聚类效果[21]。本研究选取了四季较为分明的西南及江南产区的知名茶树品种作为样本来源，采用HSSPME法结合GC-MS分析不同茶树品种加工而成的不同季节绿茶样品的香气成分，继而利用PLS-DA技术对不同季节绿茶香气成分进行判别分析，从而对不同季节绿茶间的关键差异性香气成分进行进一步的聚类分析，旨在查明不同季节绿茶香气形成差异的主要贡献成分，并探索不同季节绿茶香气成分组成及含量的分布规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

为了使分析结果更具有代表性及参考意义，本研究选用来自3 个不同产区的茶树鲜叶品种，分别为重庆永川的“碧香早（BXZ）”和“福鼎大白茶（YCFD）”、贵州铜仁的“迎霜（T RY S）”和“福鼎大白茶（TRFD）”以及安徽安庆的“皖茶91（WC）”和“舒茶早（SCZ）”。分别于2014年春季（4月20—30日）、夏季（7月21—30日）及秋季（9月12—20日）采用相同的加工工艺制备相应绿茶样品1～2 个批次，共计32 个样品，其中春季茶样12 个：铜仁福鼎的2 批次茶样、铜仁迎霜的2 批次茶样、皖茶91的2 批次茶样、舒茶早的2 批次茶样、碧香早的2 批次茶样及永川福鼎的2 批次茶样；夏季茶样10 个：铜仁福鼎的2 批次茶样、铜仁迎霜的1 个茶样、皖茶91的2 批次茶样、舒茶早的1 个茶样、碧香早的2 批次茶样及永川福鼎的2 批次茶样；秋季茶样10 个：铜仁福鼎的1 个茶样、铜仁迎霜的2 批次茶样、皖茶91的2 批次茶样、舒茶早的2 批次茶样、碧香早的2 批次茶样及永川福鼎的1 个茶样。

无水乙醚（色谱级） 美国Tedia公司；正己烷（色谱级） 德国Meker公司；纯净水 杭州娃哈哈集团；氯化钠（分析级）、愈创木酚（色谱级） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯环己烷（色谱级） 日本TCI公司；癸酸乙酯（色谱级） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

DGX-9243B-2电热恒温鼓风干燥箱 上海福玛实验设备有限公司；AB265-S电子天平 梅特勒-托利多（常州）称重设备系统有限公司；HH-2数显恒温水浴锅国华电器有限公司；QP2010 Ultra GC-MS联用仪 日本岛津公司；5 0/3 0 μ m二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷共聚物（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）SPME萃取头、SAAB-57330U SPME手柄 美国色谱科公司。

1.3 方法

1.3.1 样品加工

鲜叶采摘标准统一为一芽二叶，采用传统炒青加工工艺制备绿茶，加工步骤如下：鲜叶经过摊晾5 h→230 ℃滚筒杀青5 min→揉捻20 min→120 ℃毛火干燥15 min→摊晾1 h→90 ℃足火干燥（含水量＜5%），备用。

1.3.2 样品前处理

统计测得的岩石标本密度数据（如表1 冀北地区中生代岩浆岩部分密度数据），得知处于地表的火山岩包括火山碎屑岩、火山熔岩，一些亚类的岩石，如粗面岩、流纹岩、英安岩等，平均密度不足2.50×103kg/m3。但玄武岩、安山岩具有较高的密度，超过2.55×103kg/m3。潜火山岩、深成岩共同构成侵入地表的岩浆岩。潜火山岩、花岗岩、正长岩的亚类岩石密度菌未达到2.60×103kg/m3。但辉长岩、斜长岩、闪长岩的密度均高于2.60×103kg/m3，有的甚至超过2.70×103kg/m3，由此不难得出冀北地区中生代岩浆岩中一些偏酸性的岩石亚类密度较偏基性的岩石亚类密度低。

本研究采用HS-SPME法提取挥发性化合物，萃取步骤如下：茶水比为1∶50（g/mL），即称取3 g茶样加热水150 mL（100 ℃），在70 ℃水浴提取10 min后，通过4 层棉布过滤除去茶渣。取10 mL过滤后的茶汤至20 mL玻璃瓶中，加内标（0.002 mg/L的氯环己烷5 μL，25 mg/L的愈创木酚5 μL，0.5 mg/L的癸酸乙酯5 μL）和经过120 ℃烘干机烘干1 h以上的氯化钠2 g。盖上聚四氟乙烯瓶盖均匀振荡后，往玻璃瓶中插入含DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）萃取纤维的手动SPME装置，在40 ℃恒温水浴吸附60 min。取出后立即插入GC-MS进样口中解吸附3.5 min，同时启动仪器收集数据。

1.3.3 GC-MS条件

G C条件：进样口温度25 0 ℃，色谱柱为HP-INNOWax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流进样，载气为高纯氦（纯度为99.999%），柱流量为1 mL/min；升温程序为50 ℃保持10 min，以3 ℃/min的速率升到150 ℃保持5 min，再以10 ℃/min的速率升温至230 ℃，保持3 min。

MS条件：电子电离源，离子源温度180 ℃，电子能量-70 eV，扫描质量范围35～400 u，扫描模式为全离子扫描。

1.3.4 绿茶香气成分的定性定量

安捷伦数据工作站中NIST2014标准谱库自动检索，通过与标准质谱数据的比对，筛选匹配度达到90%以上的化合物，同时结合化合物结构分析，排除杂质或柱流失等干扰性化合物。采用内标法对最终确定的香气化合物进行相对定量，采用待测组分的峰面积与内标物的峰面积（总和）的比值作为相应化合物的相对含量。每个茶样重复测量3 次，取平均值并计算相对标准偏差。

1.4 数据统计分析

对原始数据进行标准化处理，采用Excel 2010（美国Microsoft公司）进行相对标准偏差计算及数据分析；PLS-DA采用SIMCA-P 11.5软件（瑞典Umetrics公司）完成；Mann-Whitney检验采用SPSS Statistics 20.0（美国IBM公司）分析；关键香气成分在绿茶不同季节中的分布规律使用MeV生物信息学分析软件（美国Oracle公司）中的层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）来完成。

2 结果与分析

2.1 不同季节绿茶香气成分的组成及含量

图1 绿茶挥发性成分的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in green tea

表1 不同季节绿茶样品（TRYS、TRFD及WC品种）中鉴定出的挥发性化合物及其相对含量Table1 The identif i ed volatile components and their relative contents in green tea (TRYS, TRFD and WC cultivars) harvested in different seasons

表2 不同季节绿茶样品（SCZ、BXZ及YCFD品种）中鉴定出的香气化合物及其相对含量Table2 The identif i ed volatile components and their relative contents in green tea (SCZ, BXZ and YCFD cultivars) harvested in different seasons

定量分析结果表明，虽然3 个季节绿茶的香气成分的种类基本相同，但在含量比例上有着较为显著的差异。如图2所示，在3 个季节中，醇类化合物均占有最高比例，介于49%～54%之间，其中秋季绿茶中醇类含量最高；醛类化合物在3 个季节绿茶中的含量均仅次于醇类，相对含量介于18%～32%之间，其中夏季绿茶中该类化合物含量最高；其他类化合物的含量最低，在3 个季节中相对含量均低于3%。

图2 春（A）、夏（B）、秋（C）季绿茶的挥发性化合物的分布比较Fig.2 Comparison in distribution prof i les of volatile compounds among green teas harvested in spring (A), summer (B) and autumn (C)

春季绿茶中香叶醇的含量最高（平均相对含量为10.13%），芳樟醇及顺茉莉酮的相对含量次之（平均相对含量分别为9.11%和7.16%）；夏季绿茶中，芳樟醇与（反,反）-2,4-庚二烯醛占有最高比例（平均相对含量分别为14.35%和13.15%）；秋茶中芳樟醇的相对含量最高（平均相对含量为10.06%），脱氢芳樟醇及（反,反）-2,4-庚二烯醛含量次之（平均相对含量分别为7.07%和6.31%）。香叶醇、芳樟醇及脱氢芳樟醇均属于萜烯醇类化合物，这类物质普遍具有怡人的香气和较低的香气阈值，沸点相对较高，对绿茶香气的形成有重要作用[22]。香叶醇是茶叶中含量较高的香气物质之一，在春茶中的含量最高，而夏季中降至最低，它被认为是茶叶花香来源的关键化合物[23]；芳樟醇具有百合或玉兰花香气，它本身大量存在于茶树鲜叶中，也来源于加工过程中葡萄糖苷的水解，因此在成品茶中有极高的含量，同样也被认为是茶叶花香的重要来源[22]。

2.2 不同季节绿茶香气成分的判别分析

由于茶叶香气成分繁多复杂，且受茶树品种、产区、季节及加工因素等多方面影响，很难通过简单的数据分析获得有效的变量。多元统计分析手段能够在多个对象和多个指标互相关联的情况下分析目标样品的统计规律，因此被广泛运用于茶叶科学领域。其中主成分分析（principal component analysis，PCA）是常见的统计学分析手段，在乌龙茶[24]、白茶[25]及兰香型茶叶[26]的判别分析上有广泛的应用。本研究基于不同季节绿茶香气成分的相对含量建立了相应的PCA模型，如图3a所示，统计分析结果表明，绿茶样品无法以季节为指定变量获得较好聚类效果。推测由于PCA采用无监督的降维分析方法，样品中品种及产地等因素对该模型的干扰较大，所以无法获得理想效果。PLS-DA是一种用于判别分析的多变量统计分析方法，其原理是对不同处理样本（如观测样本、对照样本）的特性分别进行训练，产生训练集，并检验训练集的可信度。该方法可以预先对所需的观察变量进行分组，后根据组别性质对数据进行统计分析，从而可以精确获悉影响分组的关键变量[15]。本研究采用SIMCA-P 11.5软件对香气检测结果进行分析，基于不同季节绿茶香气成分的相对含量建立了相应的PLS-DA模型。如图3b所示，通过该PLS-DA模型可成功区分春、夏、秋三季的绿茶样品，且良好的拟合参数（R2Y=0.903，Q2=0.570）证明了该模型的准确性。由于当变量数量大于样品数量时，使用有监督判别方法进行分析时易产生过拟合现象，因此需要使用置换检验方法考察PLS-DA在无差异情况下的建模效果[27]。如图3c所示，经过200 次交叉验证之后，Q2回归直线与Y轴的截距均小于0，表明该PLS-DA判别模型不存在过拟合现象，模型较为可靠。

PLS-DA变量重要性因子（variable importance in the projection，VIP）可以量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献，VIP值越大，变量在不同季节间差异越显著，当VIP值大于1时，可界定对应的变量为该判别模型的关键变量[15]。如表3所示，本研究已建立的PLS-DA模型中，VIP值大于1的化合物共有16 种，它们分别是顺-茉莉酮、苯甲醇、3,5-辛二烯-2-酮、反-2-辛烯醛、β-环柠檬醛、1-己醇、5,6-环氧-β-紫罗兰酮、（反,反）-2,4-庚二烯醛、壬醛、脱氢芳樟醇、2,2,6-三甲基环己酮、1-壬醇、3-甲基呋喃、1-庚醇、2-甲基呋喃及1-乙基-1-吡咯-2-甲醛，以上化合物被鉴定为不同季节绿茶间的关键差异性香气成分；其中，顺-茉莉酮的VIP值最高（1.72），其含量在不同季节绿茶间的差异极大，在春茶中的平均相对含量（7.16%）高于夏茶（0.64%），应该为受季节因素影响最大的香气化合物。此外，这16 种化合物的香气特征各不相同，主要表现为花果香、青草香、甜香及烘烤香型等（表3）[28]，推测它们在不同季节绿茶中迥异的含量分布对相应绿茶的香气品质形成有着重要的影响。

图3 不同季节绿茶香气成分PLS-DA得分图及其验证模型Fig.3 Score plot and PLS-DA model of volatile components in green teas grown in different seasons

为了使分析结果更为精确，采用Kruskal-Wallis及Mann-Whitney检验[29]对VIP值大于1的化合物进行进一步分析。如表3所示，16 种VIP值大于1的化合物中，大部分化合物的P值小于0.05，即在3 个季节样品中存在统计学差异；其中反-2-辛烯醛、1-己醇、（反,反）-2,4-庚二烯醛、壬醛、脱氢芳樟醇、2,2,6-三甲基环己酮在3 个组别样品中存在显著性差异（P＜0.01）；而VIP值大于1的顺-茉莉酮的P值小于0.001，表明其含量在组别间表现出极为显著的差异性，与PLS-DA的分析结果一致。此外，3,5-辛二烯-2-酮、1-壬醇、2-甲基呋喃及1-乙基-1-吡咯-2-甲醛的检验结果与PLS-DA差异较大，并未在组别间呈现统计学差异。因此，在综合了PLS-DA及两种非参数检验分析结果之后，鉴定出春、夏及秋季绿茶中的关键差异性成分有12 种。

表3 16 种PLS-DA模型中VIP值大于1的挥发性化合物的P值及香气特征Table3 The 16 volatile components with VIP ＞1 in PLS-DA model and their P values and aroma characteristics

2.3 不同季节绿茶关键成分的HCA

为了更直观体现这12 种关键差异性化合物在三季绿茶中的分布情况，进一步采用HCA法[30-31]对这12 种关键香气成分进行分析，生成的热图如图4所示。这12 种关键差异性成分在春、夏及秋季绿茶中的含量分布上具有一定的规律性（图中化合物相对含量从绿色到红色为逐渐升高）：I区内化合物（反-2-辛烯醛、（反,反）-2,4-庚二烯醛、2,2,6-三甲基环己酮、β-环柠檬醛、5,6-环氧-β-紫罗兰酮）在大部分夏茶中具有最高的含量，这些化合物主要为醛类和酮类，香气特征普遍偏甜香和脂肪香（表3，序号4、5、7～8、11）。由于茶树品种及种植地区的差异性较大，以上化合物在夏茶的不同样本间也显现出较大的差异性，如反-2-辛烯醛及（反,反）-2,4-庚二烯醛在永川种植的碧香早和福鼎大白茶中的含量最高，2,2,6-三甲基环己酮在铜仁福鼎大白茶、迎霜及安庆舒茶早中的含量最高，而β-环柠檬醛及5,6-环氧-β-紫罗兰酮在安庆皖茶91中的含量要显著低于其他夏茶。

II区内化合物（1-庚醇、苯甲醇、3-甲基呋喃、壬醛、顺-茉莉酮及1-己醇）在大部分春茶中的含量高于其他两季，其中醇类化合物数量最多，包括低沸点的链状脂肪醇和高沸点的苯甲醇，其中苯甲醇的含量最高，春季相对含量平均值为0.67±0.27、夏季0.20±0.05、秋季0.18±0.13；春季绿茶中铜仁的迎霜、福鼎大白茶以及安庆皖茶91中苯甲醇的含量分布更为显著。与苯甲醇分布略有不同的是，铜仁地区的茶树品种中3-甲基呋喃、壬醛及1-己醇在春、夏及秋季绿茶样品中的含量并未显现明显差异性，而其他地区或品种的茶叶样品中以上化合物的含量在春季中的含量显著高于其他两季。顺-茉莉酮是新茶的重要成分之一，有强烈而愉快的茉莉花香，对春茶优异香气品质形成起着重要的贡献作用[22,32-33]，在本研究中与PLS-DA及非参数检验分析结果对应的是，顺-茉莉酮在含量分布上的变化趋势最为明显，其含量在春茶中远高于夏、秋季绿茶，被鉴定为春茶的特征性香气成分；尤其在永川碧香早及福鼎大白茶中其相对含量（3.72±0.19，3.57±0.92）比其他春茶样品高出2～3 倍之多。II区内化合物的香气特征普遍为草本的清香及花果香（表3，序号1、2、6、9、13、14），这与春茶的感官审评结果较为一致[34-37]，说明它们可能对春茶优质香气品质形成起着重要作用。

相比春、夏绿茶，秋季绿茶的关键香气成分最少，并未呈现明显规律性，仅脱氢芳樟醇的含量在大部分秋茶中高于其他两季，其香气特征为清香、花香及木香（表3，序号10），其中安庆地区的舒茶早及皖茶91的秋茶样品中脱氢芳樟醇的相对含量最高（4.58±0.61，2.3 2±0.2 8），永川品种次之（1.8 8±0.0 2，1.10±0.22），而铜仁地区的品种中该化合物的含量并未体现明显的季节差异性。由此可见，脱氢芳樟醇的含量不仅与季节显著相关，产地因素也是影响其分布的重要因素之一。而2,2,6-三甲基环己酮、1-己醇及壬醛等化合物仅在部分品种的秋季绿茶中有较高含量，如2,2,6-三甲基环己酮在福鼎大白品种中含量最高，1-己醇及壬醛在产自铜仁地区的茶样中含量最高，可能是相应品种或地区的绿茶所具有的个体属性。

图4 12 种关键差异性香气成分在不同季节绿茶中的含量分布热图Fig.4 Heat map of 12 key aroma components among green teas harvested in different seasons

3 结 论

本实验采用HS-SPME技术结合GC-MS技术，对春、夏、秋3 季绿茶中的32 种香气成分进行定性定量分析。这些化合物根据化学结构可分为醇类14 种、酮类4 种、醛类7 种、酯类2 种、杂环类3 种、烷类1 种、其他1 种等，其中醇类的种类最多，烷类和其他类最少。研究结果表明，不同季节的绿茶中共有香气物质含量的差异性对其香气类型造成了一定的影响[38]，醇类在春、夏、秋季绿茶中含量均最高。采用基于挥发性化合物相对含量的PLS-DA模型将3 个不同季节的绿茶成功区分，并鉴定出VIP值大于1的差异性香气成分16 种；继而采用非参数检验方法辅助验证分析结果，确定在3 个季节间具有极显著性差异的化合物1 种（顺-茉莉酮）、显著性差异化合物6 种（反-2-辛烯醛、1-己醇、（反,反）-2,4-庚二烯醛、壬醛、脱氢芳樟醇及2,2,6-三甲基环己酮）及差异性化合物5 种（苯甲醇、β-环柠檬醛、5,6-环氧-β-紫罗兰酮、3-甲基呋喃及1-庚醇）。进一步的聚类分析结果表明，醇类及顺-茉莉酮等化合物在春茶中含量显著高于其他季节，它们的香气特征普遍为草本的清香及花果香；夏茶中甜香及脂肪香的醛酮化合物含量较高，其中（反,反）-2,4-庚二烯醛含量最高[39]；秋茶中的关键香气成分种类最为单一，仅清香、花香及木香型的脱氢芳樟醇的含量相对较高，其余化合物并未在秋茶中有明显规律性。此外，由于茶树品种及种植地区的差异性较大，因此尽管生产季节相同，不同品种及地区的绿茶样品仍存在一定的差异性，如脱氢芳樟醇的含量具有一定的地域特征性，顺-茉莉酮在福鼎大白品种的含量最高。然而，由于本研究旨在查明不同季节茶叶样品间的关键差异性化合物，因此在样品选择上更多考虑季节因素，并鉴定出不同地区及茶树品种来源的茶叶中的共有差异性物质。在今后的研究中，将扩大样本量研究茶叶产区及品种对茶叶香气品质的具体影响，以期为科学分析和评价不同季节绿茶的香气品质奠定良好的理论基础，也为后续优良茶树品种选育提供一定的参考依据。