麸皮多糖微生物发酵工艺优化及其抗炎活性

王 园，史俊祥，段元霄，张倩茹，孟子琪，李 暄，安晓萍*，齐景伟*

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

小麦麸皮是小麦加工面粉的副产物，是小麦提取胚芽和胚乳后的剩余部分，主要由小麦的皮层和糊粉层组成[1]。除含有一定数量的淀粉、蛋白质、脂肪外，麸皮主要含有46%左右的非淀粉多糖[2-3]，包括果胶多糖、纤维素多糖以及由阿拉伯木聚糖、混合链β-葡聚糖、葡甘露聚糖、半乳聚糖、木聚糖等组成的非纤维素多糖[4]。大量研究表明，麸皮非淀粉多糖中的非纤维多糖具有诸多生物活性，包括抑菌[5]、抗氧化[6-8]、免疫调节[9-11]和益生作用等[12-14]，故又将此类多糖称为麸皮活性多糖，简称麸皮多糖。

随着研究应用的不断深入，麦麸多糖已经在食品工业、发酵工业等领域崭露头角。麦麸多糖的传统提取方法主要有物理法[15-16]、化学法[17-19]和酶法[20-21]等。近几年，微生物发酵法得到广泛应用[22-23]，与其他方法相比，该方法具有成本低、条件温和、不受设备限制且多糖转化率较高的优点。

目前，微生物发酵法制备麸皮多糖采用的菌种多为食用菌和霉菌[24-25]，以非霉系菌种作为发酵菌种的报道较少，祁红兵等[26]研究了以纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株固态发酵麸皮的抗氧化活性。崔晨晓等[27]研究了酵母菌发酵小麦麸皮中可溶性阿拉伯木聚糖和总酚含量。本实验以酿酒酵母以及枯草芽孢杆菌为发酵菌种固态发酵小麦麸皮制备麸皮多糖，通过响应面法确定最佳发酵工艺参数，并通过敌草快攻毒建立大鼠模型研究制备的麸皮多糖的抗炎活性，以期为在生产中将麸皮多糖应用于改善动物健康状况、促进其生长提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母CGMCC 2.119以及枯草芽孢杆菌CGMCC 1.892为动物科学学院水产实验室保存；麸皮、豆粕粉和玉米粉均购于市场；乙醇、苯酚、浓硫酸、尿素、葡萄糖均为国产分析纯；营养肉汤培养基、麦芽汁液体培养基广东环凯微生物科技有限公司；无菌级Wistar大鼠内蒙古大学动物实验中心。

1.2 仪器与设备

手提式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SW-CJ超净工作台 上海新苗医疗器械公司；GX2型智力光照培养箱 宁波东南仪器有限公司；SH2-82旋转气浴恒温振荡器 金坛市岸头中旺实验仪器厂；TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪仪器开发有限公司；电热恒温水浴锅 上海医疗器械有限公司；微孔板分光光度计美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 底物配制

枯草芽孢杆菌种子液的制备：将保藏的枯草芽孢杆菌接种于灭菌（121 ℃，0.1 MPa）的营养肉汤培养基中，培养24 h（37 ℃，120 r/min），使菌体浓度达到108CFU/mL。酿酒酵母种子液的制备：将保藏的酿酒酵母接种于灭菌（121 ℃，0.1 MPa）的麦芽汁培养基中，培养24 h（37 ℃，120 r/min），使菌体浓度达到108CFU/mL。复合菌种液含有酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，比例为6.73∶3.26，总接种量10%。基础发酵底物为麸皮 80.46%、豆粕粉9.32%和玉米粉10.22%，料水比为1∶1。

1.3.2 单因素试验设计

分别研究确定发酵温度、发酵时间、总接种量和料水比对麸皮多糖产量的影响。根据预实验结果，发酵温度设定为25、30、35、40 ℃和45 ℃；发酵时间设定为24、36、48、60 h和72 h；总接种量为5%、7.5%、10%、12.5%和15%；料水比为1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2和1∶2.5（g/mL）。

1.3.3 响应面优化试验

在单因素试验基础上，确定发酵温度、发酵时间、总接种量和料水比的取值范围，采用Box-Behnken试验设计4因素3水平的响应面分析试验，以发酵底物中麸皮多糖产量为响应值，利用Minitab 17软件对数据进行分析，得出微生物发酵法制备麸皮多糖的最佳发酵工艺。响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table1 Coded levels of independent variables used in Box-Behnken design

1.3.4 麸皮多糖的提取制备

发酵麸皮湿样于45 ℃烘箱中烘干24 h后粉碎，10 g干燥发酵麸皮加入200 mL水中，80 ℃水浴30 min，离心取上清液，上清液加入4 倍体积的95%乙醇溶液，静置过夜，离心收集沉淀，沉淀烘干即为麸皮多糖；沉淀用蒸馏水复溶后即得麸皮多糖溶液。

1.3.5 麸皮多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定麸皮多糖产量[28]。麸皮多糖产量按下式计算：

1.3.6 麸皮多糖抗炎活性分析

1.3.6.1 动物实验设计

选用雄性Wistar大鼠36 只经过1 周的适应期，按实验要求将大鼠随机分为6 组。低剂量组（low-dose，CL）、中剂量组（middle-dose，CM）和高剂量组（high-dose，CH）：每天按大鼠体质量分别灌服100、200、400 mg/kg麸皮多糖；正对照组（positive control，PC）：100 mg/kg VC；负对照组（negative control，NC）：空白攻毒；正常对照组（control，CT）：空白不攻毒。实验期14 d。实验结束当天，除CT组外，其他5 组大鼠按体质量腹腔注射diquat 0.1 mmol/kg，CT组注射等量生理盐水，攻毒24 h后屠宰。

1.3.6.2 血浆和组织样品的制备

大鼠攻毒前禁食12 h，自由饮水，攻毒后24 h后乙醚致晕，心脏采血，并采集肝脏样本。血液样品采集后立即放置在冰盒中，3 000 r/min离心10 min后，-20 ℃保存。肝脏样本用生理盐水洗净后，装入无菌采样袋，浸入液氮，取出后-80 ℃冷冻保存。测定时，用含NaCl质量分数为0.86%磷酸盐缓冲溶液（phosphate buered solution，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）匀浆，3 000 r/min离心10 min后得到的上清液用于炎性因子指标测定。

1.3.6.3 炎性指标的测定

肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）根据定量测定试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司）的说明，进行酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

1.4 数据统计分析

采用Minitab 17软件进行响应面试验设计及结果分析；SAS 8.1统计软件ANOVA模型进行单因素方差分析，用Duncan’s检验进行多重比较，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵温度对麸皮多糖产量的影响

图1 发酵温度对麸皮多糖产量的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on the yield of polysaccharides

由图1可知，当发酵温度在25～45 ℃范围内变化时，发酵底物中麸皮多糖产量呈先增加后减少的趋势。发酵温度为35 ℃时达到最大值，其麸皮多糖产量为123.44 mg/g，且显著高于其他温度（P＜0.05）。因此，以发酵温度35 ℃作为响应面优化试验的发酵温度中心点。

2.1.2 发酵时间对麸皮多糖产量的影响

图2 发酵时间对麸皮多糖产量的影响Fig.2 Effect of fermentation time on the yield of polysaccharides

由图2可知，随着发酵时间的延长，发酵底物中麸皮多糖产量呈先增大后减小的趋势。在发酵第48小时达到最大值，其麸皮多糖产量为128.05 mg/g，且显著高于其他时间（P＜0.05）。因此，以第48小时作为响应面优化试验的发酵时间中心点。

2.1.3 总接种量对麸皮多糖产量的影响

图3 总接种量对麸皮多糖产量的影响Fig.3 Effect of inoculum size on the yield of polysaccharides

由图3可知，随着总接种量的增加，发酵底物中麸皮多糖产量呈先增大后减小的趋势。在总接种量为10%时达到最大值，其麸皮多糖产量为124.89 mg/g，且显著高于其他总接种量（P＜0.05）；因此，以10%总接种量作为响应面优化试验的总接种量中心点。

2.1.4 料水比对麸皮多糖产量的影响

图4 料水比对麸皮多糖产量的影响Fig.4 Effect of solid-to-water ratio on the yield of polysaccharides

由图4可知，随着溶剂用量的增加，发酵底物中麸皮多糖产量呈先增大后减小的趋势，在料水比为1∶1达到最大值，其麸皮多糖产量为122.33 mg/g，且显著高于其他料水比（P＜0.05）；因此，以料水比1∶1作为响应面优化试验的料水比中心点。

贯彻落实党的十八大精神 开创治水保安兴水富民新局面…………………………………………………………… 纪 冰(1.14)

2.2 响应面优化试验结果及方差分析

2.2.1 响应面试验结果

结合单因素试验结果，选取对发酵底物中麸皮多糖产量影响显著的4 个因素发酵温度、发酵时间、总接种量和料水比，采用4因素3水平的Box-Behnken试验设计及分析方法进行提取条件的优化，试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table2 Box-Behnken design with response variable

利用Minitab 17统计分析软件，对表3中试验数据经多元回归拟合，获得发酵产物中麸皮多糖产量（Y）对4 个因素的二次回归模型方程为：Y=126.60+5.96A+14.66B+5.49C+18.11D-37.20A2-24.07B2-33.77C2-35.16D2-3.16AB+1.66AC-0.89AD+11.22BC+6.76BD+6.56CD。

如表3所示，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P=0.247＞0.05），说明该回归模型拟合程度良好，试验误差小。复相关系数R2为96.36%，该模型预测性良好。一次项对发酵产物中麸皮多糖产量影响显著，从F值可知，4因素对发酵产物中麸皮多糖产量影响的顺序为：料水比（D）＞发酵时间（B）＞发酵温度（A）＞总接种量（C）。

表3 回归模型方差分析Table3 Analysis of variance of regression model

两因素交互作用中，BC对发酵产物中麸皮多糖产量影响显著（P＜0.05），其他两因素交互作用对发酵产物中麸皮多糖产量影响不显著（P＞0.05）。二次项A2、B2、C2对发酵产物中麸皮多糖产量均有极显著影响（P＜0.05），进一步说明各具体试验因素对发酵产物中麸皮多糖产量的影响不是简单的线性关系。

图5 各交互因素对发酵产物中麸皮多糖产量影响的响应面Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on the yield of polysaccharides

由图5可知，4 个变量在两两交互时，保持其中2 个变量不变，麸皮多糖产量随着另外2 个变量水平的增加，呈现上升到一定程度后下降的趋势。对应麸皮多糖产量最大值都在120 mg/kg以上。

2.2.2 最佳发酵条件及验证

由Minitab 17统计分析软件中响应面优化器得到：当发酵温度35.4 ℃、发酵时间52.7 h、总接种量10.4%、料水比1∶1.16时，发酵产物中麸皮多糖含量的理论值为132.9 mg/g。用得到的最佳发酵条件进行验证实验，6 次平行实验得到发酵产物中实际麸皮多糖含量为130.21 mg/g，与理论值相差2%，说明此模型有效且优化结果可靠。较未发酵底物中麸皮多糖含量（27.01 mg/g）提高了3.8 倍。

2.3 麸皮多糖的抗炎活性分析

2.3.1 血浆中炎性因子指标

表4 麸皮多糖粗制品对大鼠血浆中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量的影响Table4 Effects of polysaccharides from fermented wheat bran on the levels of IL-1β, IL-2, IL-6 and TNF-α in the plasma of rats pg/mL

如表4所示，与CT组相比，NC组血浆中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量显著升高（P＜0.05）。CL组中IL-1β含量显著低于NC组（P＜0.05），与CT组差异不显著（P＞0.05）；CM组中的IL-1β和TNF-α含量显著低于NC组（P＜0.05），与CT组差异不显著（P＞0.05）；CH组中的IL-1β、IL-2和TNF-α含量显著低于NC组（P＜0.05），且与CT组差异不显著（P＞0.05）；PC组IL-1β含量显著低于NC组（P＜0.05），与CT组差异不显著（P＞0.05）。这表明灌胃发酵制备的麸皮多糖可以缓解由diquet引起的大鼠血浆中炎性因子含量的升高，并且随着灌服剂量的升高，大鼠血浆中炎性因子含量逐渐恢复至正常水平。

2.3.2 肝脏中炎性因子指标

表5 麸皮多糖粗制品对肝脏中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量的影响Table5 Effects of polysaccharides from fermented wheat bran on the levels of IL-1β, IL-2, IL-6 and TNF-α in the liver of rats pg/mg

如表5所示，与CT组相比，NC组肝脏中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量显著升高（P＜0.05）。CL组中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著低于NC组（P＜0.05），但显著高于CT组（P＜0.05）；CM组IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著低于NC组（P＜0.05），且与CT组差异不显著（P＞0.05）；CH组IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量显著低于NC组（P＜0.05），且与CT组差异不显著（P＞0.05）；PC组IL-1β含量显著低于NC组（P＜0.05），与CT组差异不显著（P＞0.05）。这表明灌胃发酵制备的麸皮多糖可以缓解由diquet引起的大鼠肝脏组织中炎性因子含量的升高，并且随着灌服剂量的升高，大鼠肝脏组织中炎性因子含量逐渐恢复至正常水平。

3 讨论与结论

酿酒酵母CGMCC 2.119具有同化五碳糖的特点，可在玉米芯水解液中生长[29]。枯草芽孢杆菌则能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶[30]。并根据前期实验结果发现，混合菌种发酵麸皮多糖产量为64.91 mg/g，而酿酒酵母和枯草芽孢杆菌作为单一菌种发酵麸皮多糖产量分别为31.07 mg/g和30.60 mg/g，两种菌混合发酵制备的麸皮多糖产量显著高于单一菌种发酵，因此，本实验选取酿酒酵母和枯草芽孢杆菌作为混合菌种发酵生产麸皮多糖。对于固态发酵这样一种复杂的生化过程来说，发酵条件是一个重要的影响参数，直接影响发酵产品的品质。不同的发酵菌种由于其自身的菌种特异性，需要不同的发酵条件以完成生长代谢和发酵产物的生成。尤其在混菌发酵过程中，由于不同的发酵菌种有不同的最适发酵条件，为了使发酵效果最好，得到更多的目的产物就必须对混菌发酵的发酵条件进行优化，本研究通过结合单因素法和响应面优化法快速、准确地确定发酵需要的适当条件，并且优化后理论值与实际值基本一致，说明利用响应面法优化本实验条件是有效的。

机体处于氧化应激状态时，会产生大量的炎症介质和细胞因子扩大氧化应激造成组织器官的损害[31]。敌草快是二吡啶基除草剂，它能利用分子氧产生超氧阴离子和过氧化氢，继而产生其他自由基，诱导机体产生氧化应激[32]。在本实验中，diquat作为攻毒剂，腹腔注射后可以激活炎性细胞，促进如TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6等炎性细胞因子的合成和释放，导致血浆和肝脏组织中的炎症因子水平显著提高（P＜0.05）。麸皮多糖灌胃处理组的大鼠，血浆和肝脏组织中其部分炎性细胞因子水平显著降低（P＜0.05），并且表现出随麸皮多糖灌胃剂量的升高而降低效果更显著，逐渐恢复到正常水平。Kang等[33]研究发现，经酶处理释放阿拉伯木聚糖的麦麸可以有效抑制由LPS引起的小鼠血清TNF-α和IL-6等炎性细胞因子的升高趋势，表现出一定的抗炎作用，这一结果与本研究结果一致。

本研究在单因素试验的基础上，经响应面试验优化，以酿酒酵母以及枯草芽孢杆菌为发酵菌种制备麸皮多糖的最适发酵工艺条件为发酵温度35.4 ℃、发酵时间52.7 h、总接种量10.4%、料水比1∶1.16，该条件下麸皮多糖产量为130.21 mg/g。以diquat攻毒建立大鼠炎症模型，发现麸皮多糖可以有效缓解大鼠血液和肝脏组织中TNF-α、IL-6、IL-2和IL-1β炎性因子水平的升高，表现出一定的抗炎作用。