双波长瑞利光散射技术测定食品中的Cu

江 虹，王 芳，吴征真，曾庆瑞

（长江师范学院化学化工学院，武陵山片区绿色发展协同创新中心，重庆 408100）

Cu是人体必需的微量元素之一，对维持机体的正常代谢具有重要作用，它参与多种酶的构成，参与造血及形成色素，影响中枢神经系统、内分泌、生殖及免疫机能。若人体内缺Cu，会发生贫血、腹泻、头晕、眼花、耳鸣、乏力、生长停滞、骨质疏松、冠心病和糖尿病等疾病；若人体Cu过量，则会引起恶心、呕吐、上腹疼痛等中毒现象[1]。人体中的Cu主要从日常饮食中摄入，而日常食品如饼干、面条、奶粉等通常由于加工中使用Cu器设备而受到污染，因此研究食品中Cu具有重要意义。

目前测定Cu的方法主要有：原子吸收法[2-6]、电感耦合等离子体质谱法[7-10]、电化学法[11-21]、分光光度法[22-27]、荧光法[28-30]等。原子吸收法因分析成本高，所用仪器价格较贵而不易普及。电感耦合等离子体质谱法有较高的灵敏度和准确度，但分析成本高、仪器贵，仍不易普及。其他方法或灵敏度较低或实验条件要求较苛刻或分析成本较高。瑞利光散射（Rayleigh light scattering，RLS）技术是近年新发展起来的一种高灵敏分析技术，在食品分析方面应用较少，尤其是用双波长瑞利光散射（dual-wavelength Rayleigh light scattering，DWO-RLS）法测定食品中Cu的含量，目前尚鲜见文献报道。本实验以溴甲酚绿（bromocresol green，BRG）作探针，在酸性溶液和阳离子表面活性剂——溴代十六烷基吡啶（hexadecylpyridinium bromide，TPB）存在下，用DWORLS技术测定Cu的含量，得到较满意的结果。实验发现，该体系的谱线上有两个较大的散射峰，在最大和次大散射波长处Cu（II）的质量浓度在一定范围内与体系的RLS猝灭程度（ΔIRLS）有线性关系，该方法简便、快速、灵敏，适于食品中Cu的快速测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

钙奶饼干（1#）、儿童营养饼干（2#）、饼干（3#、4#）、面条（5#、6#）、幼儿配方奶粉（7#、8#）、婴儿配方奶粉（9#、10#） 市售；TPB 上海乙基化工有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris） 齐一生物科技（上海）有限公司；BRG 天津市科密欧化学试剂有限公司；Cu(NO3)2·3H2O（99.9%） 国药集团化学试剂有限公司；超纯水；试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

F-2500型荧光分光光度计 日本日立公司；pHS-3C精密酸度计 上海虹益仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

C u（I I）标准溶液：准确称取一定量的Cu(NO3)2·3H2O于小烧杯中，用水溶解，配成6.355 mg/L贮备液，工作液为0.6355 mg/L。BRG溶液：称取适量溴甲酚绿于小烧杯中，加少量无水乙醇使其溶解，再转移至1 000 mL容量瓶中，用水定容，配成1.0×10-3mol/L的溶液，工作液为1.0×10-4mol/L。TPB溶液：称取适量的TPB，加少量无水乙醇溶解，用水稀释配成4.00×102mg/L。Tris-盐酸溶液：将适量的0.10 mol/L盐酸溶液与适量的0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度计测定，配成pH 3.0～8.5的Tris-盐酸溶液。

1.3.2 样品处理

在电子天平上用固定质量称量法准确称取1.1节中已捣碎、混匀、并按四分法缩分的1#样品5.000 0 g，2#～10#样品各10.000 0 g（允许误差±0.0001 g）于各瓷坩埚中，置于可调电炉上，在低温下加热至样品完全炭化后，再将温度调至500～550 ℃，灼烧灰化约5 h，冷却后，取出坩埚，用体积比为1∶1 HNO3溶液（取50 mL浓HNO3置于适量水中，再用水稀释至100 mL）2.0 mL润湿灰分，再在电炉上低温加热蒸干，然后在500～550 ℃条件下灼烧约2 h，冷却后，取出坩埚，加入1∶1 HNO3溶液2.0 mL，水8 mL，搅拌，低温加热使灰分完全溶解，待冷却后，过滤，滤液置于100 mL容量瓶中，再加1∶2三乙醇胺溶液（三乙醇胺和水的体积比为1∶2）（掩蔽Fe3+、Al3+）3.0 mL，用水稀至刻度，即为待测液。

1.3.3 RLS强度的测定

在具塞比色管中，依次准确加入1.0 0 m L pH 4.81 Tris-盐酸溶液，3.00 mL 1.0×10-4mol/L BRG溶液，0.20 mL 4.00×102mg/L TPB溶液及适量的0.6355 mg/L Cu（II）标准溶液（或样液），用超纯水稀释至10.0 mL刻度，摇匀，35 min后，将溶液于荧光光度计上（λex=λem=220 nm）进行同步扫描（测定狭缝5 nm），得光谱，记录最大波长528 nm和次大波长361 nm处体系和试剂空白的RLS强度IRLS（528 nm）、IRLS（361 nm）及I0（528 nm）、I0（361 nm），按照以下公式进行计算：

2 结果与分析

2.1 Cu（II）-TPB-BRG的RLS光谱

图1 BRG-Cu（II）-TPB的RLS光谱Fig.1 RLS spectra of bromocresol green-Cu(II)-cetylpyridine bromide

从图1可知，Cu（II）、BRG及TPB溶液在实验测定条件下，其自身的RLS光谱十分微弱（曲线1～3），BRG在Tris-盐酸的酸性溶液中的RLS也很微弱（曲线4），TPB在Tris-盐酸的酸性溶液中较微弱（曲线5）。当BRG与TPB在酸性Tris-盐酸溶液中混合后RLS信号显著增强（曲线6），光谱曲线上出现3 个明显的RLS峰，最大峰位于528 nm，次大峰位于361 nm，相对最小的散射峰位于306 nm；RLS增强的原因主要：BRG是一种酸性染料，其分子结构上有2 个可离解的酚基氢，在溶液中离解后带负电荷，而TPB是一种阳离子表面活性剂，其分子结构上有1个可离解的Br-，在溶液中离解后带正电荷，在实验条件下，带正电荷的阳离子表面活性剂TPB以预胶束聚集体存在，而带负电荷的BRG则在其表面聚集，从而导致RLS光谱急剧增加，这也表明TPB可增敏BRG，生成离子缔合物，使RLS增强。当在BRGTPB的酸性Tris-盐酸溶液中加入不同浓度的Cu（II）标准溶液后，在最大、次大和最小散射波长处，随着Cu（II）浓度的不断增大，BRG-TPB-Cu（II）体系的RLS强度不断降低，即Cu（II）的加入使体系的RLS发生猝灭作用（曲线6～12）。猝灭原因：Cu（II）的加入，破坏了BRG-TPB缔合物原有的平衡，部分BRG转而与Cu（II）结合，从而导致BRG与TPB的分离，结果使RLS降低。实验表明，在361 nm和528 nm处，无论是用单波长法测定还是用DWO-RLS测定，Cu（II）在一定浓度范围内其质量浓度与BRG-TPB-Cu（II）体系的猝灭程度ΔIRLS呈线性关系（曲线6～12），但用DWO-RLS测定时，其灵敏度约为单波长法的2 倍，故选择用DWO-RLS法定量测定Cu（II）。

2.2 反应条件的选择

2.2.1 介质酸度的影响

室温条件下，考察在不同pH值的Tris-盐酸介质存在下，对BRG-TPB-Cu（II）体系ΔIRRS的影响。结果表明：BRG-TPB的RLS受酸度的影响较小，但加入Cu（II）后，BRG-TPB-Cu（II）体系的RLS受酸度的影响则较大。图2为加入Cu（II）后，在528、361 nm 及（528+361）nm 波长处，BRG-TPB- Cu（II）体系的RLS增强强度（或猝灭程度）的绝对值│ΔIRLS│随溶液pH值的变化情况。图2不仅表明适宜酸度范围为pH 4.2～5.3（在该范围内，体系的猝灭程度较大，即│ΔIRLS│较大，灵敏度较高），还表明用DWO-RLS法测定的灵敏度比单波长法更高。故实验用DWO-RLS法进行测定，使用pH 4.81的Tris-盐酸溶液作反应介质，适宜用量为1.00 mL。

图2 pH值的影响Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLS

2.2.2 BRG溶液浓度的影响

图3 BRG浓度的影响Fig.3 Effect of bromocresol green concentration on ΔIRLS

从图3可知，当BRG溶液的浓度增加到3.00×10-5mol/L时，Cu（II）的加入使体系的猝灭作用达到最大，即│ΔIRLS│最大，灵敏度相对最高。同时图3也表明，用DWO-RLS法测定，其灵敏度比单波长法高。故实验采用DWO-RLS法进行测定，选用1.00×10-4mol/L BRG溶液的浓度为3.00 mL。

2.2.3 表面活性剂的影响

室温条件下，考察TPB、溴化十六烷基三甲基铵、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、Tween-20、Triton X-100等对BRG-TPB-Cu（II）体系ΔIRLS的影响。结果表明，只有TPB和溴化十六烷基三甲基铵对体系有增敏性，尤以TPB效果最好。继而研究了不同浓度的TPB溶液对BRG-TPB- Cu（II）体系ΔIRLS的影响，结果表明：当TPB浓度为8.00 mg/L时，Cu（II）的加入使体系的猝灭作用达最大，即│ΔIRLS│最大，灵敏度相对最高。同理，用DWO-RLS法测定的灵敏度比单波长法高，故实验用DWORLS法进行测定，使用4.00×102mg/L TPB溶液0.20 mL。

2.2.4 试剂加入顺序的影响

室温条件下，考察在优化的反应条件下试剂在不同加入顺序时对BRG-TPB- Cu（II）体系ΔIRLS的影响。结果表明，按1.3.3节DWO-RLS强度的测定中的试剂加入顺序为最佳。故实验按Tris-盐酸溶液、BRG溶液、TPB溶液、Cu（II）标准溶液的顺序加入各试剂。

2.2.5 体系的反应速度及稳定性

室温条件下，考察BRG-TPB- Cu（II）体系在不同反应时间对ΔIRLS的影响。结果表明，BRG与TPB的反应很快就能完成，当加入Cu（II）溶液后，随着时间的延长，体系的RLS强度逐渐降低，35 min后RLS信号趋于稳定，稳定时间至少可保持1.5 h。即BRG、TPB及Cu（II）之间在35 min内可以反应完全，故实验选在35 min后测定。

2.3 标准曲线及相关参数

在优化条件下，按DWO-RLS强度的测定方法配制Cu（II）的标准系列溶液，并扫描RLS光谱。以ΔIRLS对相应的Cu（II）的质量浓度（ρ）作图绘制标准曲线。标准曲线的一元线性回归方程、相关系数、线性范围及方法的检出限见表1。由表1可知，用DWO-RLS法测定的灵敏度比单波长法高。

表1 标准曲线相关参数Table1 Calibration standard curves, LODs and LOQs

2.4 方法的选择性

在0.063 6 mg/L Cu（II）存在下，用DWO-RLS法考察了某些常见阴、阳离子对Cu（II）测定的影响，结果见表2。由表2可知，除Fe3+、Al3+的允许量相对较小，可能有一定的干扰外，其他阴、阳离子均不干扰测定。而Fe3+、Al3+的干扰可加入1∶2的三乙醇胺溶液1.0 mL予以掩蔽。故该方法具有好的选择性。

表2 共存物质的影响Table2 Effect of coexisting substances

2.5 样品分析结果

表3 样品分析结果及回收实验（n=5）Table3 Recoveries of Cu from spiked real samples (n= 5)

取1.3.2节中的待测样液各2.00 mL，按DWO-RLS强度的测定方法加入各试剂溶液并扫描RLS光谱，各平行测定5份，根据测得的ΔIRLS，在DWO-RLS法的标准曲线或回归方程上求得各待测样液的浓度并推至原始样品的含量。同时作加标回收实验，各平行测定5份，求出平均回收率。由表3可知，本法测定结果与GB/T 5009.13—2003《食品中铜的测定》中的火焰原子吸收法基本一致，回收率为98.6%～103%，相对标准偏差为1.8%～2.5%，结果表明，方法有较高的准确度和精密度。

3 结 论

定量检测Cu含量的DWO-RLS法与国标法中的火焰原子吸收法相比，对仪器的要求和仪器的使用成本更低，操作更简便、快速；而灵敏度方面，国标法中的火焰原子吸收法的检出限为1.0 mg/kg，本体系的单波长法在361 nm和528 nm处的检出限分别为9.81 ng/mL和8.62 ng/mL，双波长法的检出限为4.61 ng/mL，由此可知，无论是单波长法还是双波长法其灵敏度均比国标法好，其中又以双波长法更灵敏。除此之外，本法有较宽的线性范围，准确度、精密度及选择性均能较好的满足痕量分析要求。方法所用试剂价廉易得，样品处理安全、可靠，适于多种食品中Cu的快速测定。