732阳离子交换树脂对屎肠球菌谷氨酸脱羧酶活性的促进作用

杨胜远，韦 锦，曾 婵，彭罗慧

（1.岭南师范学院化学化工学院，广东 湛江 524048；2.岭南师范学院 热带与南海资源协同创新中心，广东 湛江 524048；3.岭南师范学院图书馆，广东 湛江 524048）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种具有4 个碳原子的非蛋白质组成氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统主要的抑制性神经递质，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、降血压、镇静和改善睡眠等作用[1-4]，可抑制结肠癌细胞增殖和增强结肠癌细胞对抗肿瘤药奥沙利铂的敏感性[5]，已成为备受关注的药品和保健品成分。由于可以通过内酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，因此GABA还是生产生物塑料聚酰胺4的重要原料[6-7]。

微生物生长繁殖快，因其生产GABA不受时间和空间限制，利用微生物谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15）生产GABA备受关注[2,8]。GAD是一种依赖于磷酸吡哆醛的裂解酶，存在于细胞质中，是生物体催化L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu）发生α-羧基脱羧作用生成GABA的唯一酶[9]。由于GAD作用的底物（L-Glu）和产物（GABA）均为小分子，可以透过细胞膜，因此可以直接采用细胞转化法生产GABA，减少胞内酶的提取成本，简化生产工艺。已有文献通过唾液链球菌嗜热亚种[10]、戊糖片球菌[11]、屎肠球菌[12]、短乳杆菌[13]、大肠杆菌[14-15]细胞转化法制备GABA的报道。然而，由于微生物GAD活性普遍不高，GABA产量偏低，成本高，难以满足工业化生产需求。因此，如何提高微生物GAD活性、提高具有高活性GAD细胞的产量以及通过改善细胞转化反应体系或工艺条件，提高GABA的产量，降低生产成本，将是今后亟需解决的关键问题。

固体酸是绿色化学领域一类重要的酸碱催化剂，在绿色化学催化反应中已经引起极大的关注和研究。732阳离子交换树脂选择性高，后处理简便，价廉易得、不污染环境、不腐蚀设备，容易分离及回收，可重复使用，已广泛用于物质的分离纯化。732阳离子交换树脂在离子交换的过程中，能够给出质子或者接受电子对，因此也可以作为酸碱催化反应体系的固体酸。虽然固体酸在绿色化学领域研究报道较多，但是在生物酶催化反应体系中的应用尚鲜见报道。

本实验在前期对多种固体酸的筛选基础上，对732阳离子交换树脂在屎肠球菌细胞转化法生产GABA的应用条件进行了探讨，以期为开发生物合成GABA新工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

屎肠球菌（Enterococcus faecium）LNSF2为岭南师范学院绿色生物制造研究室保藏菌株，分离自泡菜。

GABA（质量分数≥9 9%）、异硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC） 美国Sigma公司；乙腈、乙酸、三乙胺（均为色谱纯） 美国Tedia公司；732阳离子交换树脂 廊坊沃恒化工有限公司。

改良PSB培养基为在文献[16]的PSB培养基基础上进一步优化，培养基组成为：蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、蔗糖12.5 g/L、乙酸钠6.0 g/L、谷氨酸一钠（monosodium glutamate，MSG）10 g/L、吐温80 1.0 g/L，pH 6.8。将改良PSB培养基分装于100 mL/250 mL三角瓶，121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

1200 Series高效液相色谱仪（配置G1354A四元梯度泵、G1316A柱温箱、G1314B可变波长紫外检测器、Chemstation工作站等） 美国安捷伦公司；PSH-200生化培养箱 中科生命科技股份有限公司；Centrifuge 5804R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；VX-200涡旋混合仪 美国Labnet公司；AUW120电子分析天平 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

从4 ℃保藏的E. faecium LNSF2斜面挑取1 环，接入改良PSB培养基中，37 ℃静置培养12 h，然后按体积分数1%的接种量接入改良PSB培养基，于37 ℃静置培养12 h作为种子液。

1.3.2 E. faecium LNSF2发酵方法

将E. faecium LNSF2种子液按体积分数2%的接种量接入改良PSB培养基，于37 ℃静置培养48 h，作为发酵醪。

1.3.3 E. faecium LNSF2菌悬液制备

将发酵醪在4 ℃于8 500 r/min离心20 min，收集菌体。分别在含菌体的离心管中加入30 mL 0.85 g/L NaCl溶液，混匀，然后在4 ℃于8 500 r/min离心15 min，收集菌体，每克湿菌体中加入10 mL pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，均质分散均匀，制成100 mg/mL菌悬液。

1.3.4 溶液的配制

0.3 mol/L MSG底物溶液的配制：称取MSG 56.31 g溶于40 ℃乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.2，0.2 mol/L或0.4 mol/L）900 mL，调节pH 4.2，定容至1 L。MSG终浓度为0.3 mol/L。

0.2 mol/L MSG-0.2 mol/L GABA混合溶液配制：称取MSG 3.746 0 g和GABA 2.062 0 g溶于90 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.2，0.2 mol/L），调节pH 4.2，定容至100 mL。MSG及GABA终浓度均为0.2 mol/L。

1.3.5 GABA和L-Glu含量的测定

1.3.5.1 流动相

参照文献[17]进行配制。流动相A：称取8.205 g乙酸钠，溶于900 mL超纯水，加入三乙胺0.5 mL、乙酸0.7 mL和乙腈5.0 mL，调节至pH 5.8，定容至1 000 mL。流动相B：乙腈-水（60∶40，V/V）。

1.3.5.2 衍生化方法

衍生化方法参照文献[18]，略作改进。取100 μL标准溶液或转化反应终止液注入1.5 mL的锥形离心管，加入50 μL乙腈-水-三乙胺-PITC（7∶1∶1∶1，V/V），混匀，室温放置1 h后，加入150 μL流动相A-流动相B（80∶20，V/V）混合液，涡旋混合仪振荡1 min，然后加入600 μL正己烷，涡旋混合仪振荡1 min，静置10 min。用注射器吸取下层溶液，经0.22 μm滤膜过滤备测。

1.3.5.3 色谱条件

参照文献[17]，略有改变。色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长254 nm；进样量20 μL；柱温25 ℃。采用流动相A-流动相B（80∶20，V/V）以0.6 mL/min进行洗脱。

1.3.6 732阳离子交换树脂交换物的洗脱

采用0.15 mol/L Na2CO3溶液进行洗脱。将树脂与0.15 mol/L Na2CO3按1∶10（g/mL）混合，室温振荡洗脱5 min，滤布过滤，取洗脱液，树脂重复洗脱2 次，合并洗脱液。将洗脱液于4 ℃、8 500 r/min离心5 min，取上清液备测。

1.3.7 pH值对细胞GAD活性影响的测定

分别取pH值为3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2的0.3 mol/L MSG溶液（以0.4 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液配制）1 mL，加入菌悬液1 mL，40 ℃水浴反应6 h，加入无水乙醇8 mL，混匀，8 500 r/min离心15 min，取上清液备测。以pH值分别为3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2不含MSG的0.4 mol/L乙酸-乙酸盐缓冲液1 mL替代MSG溶液按同样操作作为对照。细胞GAD活力单位定义为：在上述测定条件下1 h生成1 μmol GABA所需要的酶量为1个酶活单位（U）。GAD活性以每毫升反应液的酶活力单位表示，即U/mL。

1.3.8 732阳离子交换树脂对L-Glu和GABA交换能力的测定

称取树脂2 g，加入4 mL 0.2 mol/L MSG-0.2 mol/L GABA混合溶液，混匀并静置5 min，滤布过滤，然后将树脂放入4 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.2），静置5 min，洗涤未交换或吸附不牢的L-Glu或GABA，重复洗涤2 次，再对交换或吸附在树脂上的物质进行洗脱，分别测定洗脱液GABA和L-Glu的含量。

1.3.9 不同离子型的732阳离子交换树脂对反应缓冲体系pH值影响的测定

分别称取H型和Na型732树脂25 g，加入0.2 mol/L、pH 4.2乙酸-乙酸钠缓冲液50 mL，混匀，立即测定溶液的pH值，然后再置于40 ℃、80 r/min水浴振荡器1 h，冷却，测定溶液的pH值。以不加树脂的0.2 mol/L、pH 4.2乙酸-乙酸钠缓冲液50 mL按同样处理作为对照。

1.3.10 732阳离子交换树脂pH值的平衡

称取经水洗至中性并用纱布滤干水分的732阳离子交换树脂20 g，加入0.2 mol/L、pH 4.2的乙酸-乙酸钠缓冲液40 mL，室温浸泡30 min（间歇搅拌），纱布过滤，再在树脂中加入0.2 mol/L、pH 4.2的乙酸-乙酸钠缓冲液40 mL，室温浸泡30 min（间歇搅拌），纱布过滤。重复按此操作直至前后2 次的滤液pH值一致，表明已平衡至终点。

732阳离子交换树脂的L-Glu平衡则在0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.2）平衡的基础上，再用含0.2 mol/L L-Glu的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.2，0.2 mol/L）平衡2 次。

1.3.11 732阳离子交换树脂对GAD活性影响的测定

称取已用乙酸-乙酸钠缓冲液或含L-Glu的乙酸-乙酸钠缓冲液平衡的树脂10 g，加入0.3 mol/L MSG溶液10 mL、菌悬液10 mL，混匀，然后于80 r/min、40 ℃水浴振荡器反应24 h，纱布过滤，分别收集滤液（记为转化液）和树脂，再对树脂进行洗脱（记为洗脱液）。分别将转化液和洗脱液于4 ℃、8 500 r/min离心15 min，取上清液用于测定pH值和GABA含量。以不加树脂按同样操作作为对照组。

1.3.12 反应时间对732阳离子交换树脂对GAD活性影响的测定

称取已用含L-Glu的乙酸-乙酸钠缓冲液平衡的树脂10 g，加入0.3 mol/L MSG溶液10 mL、菌悬液10 mL，混匀，然后于80 r/min、40 ℃水浴振荡器分别反应3、6、9、12 h和24 h，纱布过滤，分别收集滤液（记为转化液）和树脂，再对树脂进行洗脱（记为洗脱液）。分别将转化液和洗脱液于4 ℃、8 500 r/min离心15 min，取上清液用于测定pH值和GABA含量。以不加树脂按同样操作作为对照组。

1.3.13 732阳离子交换树脂添加量对GAD活性影响的测定

分别称取已用含L-Glu的乙酸-乙酸钠缓冲液平衡的树脂5、7.5、10、12.5、15 g，分别加入0.3 mol/L MSG溶液10 mL、菌悬液10 mL，混匀，然后于80 r/min、40 ℃水浴振荡器反应24 h，纱布过滤，分别收集滤液（记为转化液）和树脂，再对树脂进行洗脱（记为洗脱液）。分别将转化液和洗脱液于4 ℃、8 500 r/min离心15 min，取上清液用于测定pH值和GABA含量。以不加树脂按同样操作作为对照组。

1.3.14 L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物添加量对GAD活性影响的测定

称取已用含L-Glu的乙酸-乙酸钠缓冲液平衡的树脂10 g，加入0.3 mol/L MSG溶液10 mL、菌悬液10 mL，再按反应体系液体积分别加入15、30、45 g/L和60 g/L的L-Glu/MSG（质量比2∶1）固体混合物，混匀，然后于80 r/min、40 ℃水浴振荡器反应24 h，纱布过滤，分别收集滤液（记为转化液）和树脂，再对树脂进行洗脱（记为洗脱液）。分别将转化液和洗脱液于4 ℃、8 500 r/min离心15 min，取上清液用于测定pH值和GABA含量。以不加树脂按同样操作作为对照组。

1.4 数据分析

实验结果采用IBM SPSS Statistics 19.0软件以独立样本t检验进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 pH值对细胞GAD转化活性的影响

图1 pH值对屎肠球菌LNSF2细胞GAD活性的影响Fig.1 Effect of pH on the GAD activity of E. faecium LNSF2 cells

由图1可见，细胞GAD的最适反应pH值为4.4，当反应体系的pH值大于4.4时，细胞GAD活性迅速下降。由于GAD催化L-Glu脱羧生成GABA，反应体系pH值会升高，如采用最适转化反应pH值作为催化反应体系pH值，将会增加pH值的控制难度，因此选择pH 4.2作为细胞转化反应体系的pH值。

2.2 732阳离子交换树脂对转化反应缓冲体系pH值的影响

表1 不同离子型732阳离子交换树脂对反应缓冲体系pH值及其对物质交换能力的影响Table1 Effect of different ion types of 732 cation-exchange resins on pH of the reaction buffer system and their exchange capacity

由表1可知，加入H型或Na型732阳离子交换树脂后，乙酸-乙酸钠缓冲液的pH值均发生改变，H型树脂会造成缓冲液的pH值下降，Na型树脂则会造成缓冲液的pH值升高。反应体系的pH值是细胞转化反应的重要条件，pH值降低或升高均会导致GAD活性大幅下降（图1）。

同时，缓冲液体系pH值的改变，也将影响树脂对转化反应体系L-Glu（底物）和GABA（产物）的交换能力。由表1可知，在含L-Glu和GABA的pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液中，H型树脂对L-Glu交换能力大于GABA，而Na型树脂对GABA交换能力大于L-Glu。结果表明，不同离子型732阳离子交换树脂会因为离子的游离或与环境介质的离子交换而改变反应体系pH值，导致物质的电离状态发生改变，从而改变树脂与物质的交换能力。

因此，732阳离子交换树脂应用于酶催化反应体系，必须先平衡至反应体系的pH值，防止树脂改变反应体系的初始pH值。

2.3 732阳离子交换树脂对GAD活性的影响

表2 732阳离子交换树脂对屎肠球菌LNSF2细胞GAD活性的影响Table2 Effect of 732 cation-exchange resins on the GAD activity of E. faecium LNSF2 cells

由表2可知，经含L-Glu的pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液平衡的732阳离子交换树脂可显著提高屎肠球菌细胞GAD转化活性，转化反应24 h，GABA产量较对照组提高了25.31%（P＜0.05）。然而，仅采用pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液平衡的732阳离子交换树脂对屎肠球菌细胞GAD转化活性却未表现促进作用，GABA产量反而降低了3.32%，但与对照组无显著差异（P＞0.05）。由于732阳离子交换树脂对GAD转化反应底物（L-Glu）有一定交换能力，因其交换了部分L-Glu，从而导致反应体系游离的底物浓度下降，进而影响GAD的催化反应速率，这可能是未经L-Glu平衡的树脂产量略低于对照组的原因。

上述分析表明，经L-Glu平衡的732阳离子交换树脂可显著提高细胞GAD活性，增加GABA产量，因此选择含L-Glu的pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液平衡的732阳离子交换树脂与屎肠球菌细胞构建复合转化体系。

2.4 反应时间对732阳离子交换树脂-细胞GAD复合转化体系的影响

图2 反应时间对732阳离子交换树脂对屎肠球菌LNSF2细胞GAD转化活性的影响Fig.2 Effect of reaction time on the GAD activity of E. faecium LNSF2 cells in the presence of 732 cation-exchange resins

由图2可知，在转化反应3 h内，加732阳离子交换树脂实验组的GABA产量与对照组相差不大，分别为（0.65±0.01）mmol和（0.64±0.06）mmol。随着反应时间延长，实验组的GABA产量逐渐高于对照组，转化反应24 h，实验组的GABA产量为（3.03±0.09）mmol，较对照组GABA产量（2.37±0.18）mmol提高了27.64%。结果表明，转化反应24 h的GABA产量和增产率均最大，因此选择转化反应时间为24 h。

2.5 732阳离子交换树脂不同添加量对细胞GAD转化活性的影响

图3 732阳离子交换树脂不同添加量对屎肠球菌LNSF2细胞GAD转化活性的影响Fig.3 Effect of the amount of 732 cation-exchange resins on the GAD activity of E. faecium LNSF2 cells

图3显示，随着732阳离子交换树脂添加量增加，GABA的产量也增加，当实验体系732阳离子交换树脂的添加量达到10 g时，GABA产量达到了（2.99±0.08）mmol，较不添加732阳离子交换树脂的对照组GABA产量（2.26±0.07）mmol增加了32.30%，继续增加732阳离子交换树脂添加量，GABA的产量和增产率趋于平缓。因此，在实验设计的20 mL转化反应体系中，732阳离子交换树脂的添加量为10 g较为适宜。

2.6 不同固体底物添加量对732阳离子交换树脂-GAD催化体系活性的影响

由于L-Glu在水中的溶解度较小，仅为0.86%（25 ℃）[19]，在pH 4.2的酸性环境中其溶解度更小，本研究采用MSG配制的0.3 mol/L L-Glu底物溶液已经接近L-Glu在0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.2）中的饱和浓度。L-Glu是弱酸，与其一钠盐可以组成弱缓冲体系，杨胜远等[10]研究表明，当L-Glu与MSG以2∶1混合时，其溶液pH值为4.2，当L-Glu和MSG添加量超过其溶解度时，将以固体形式存在，当溶液中的L-Glu作为GAD催化反应底物消耗时，固态L-Glu可溶解到反应体系的溶液中，在一定程度上可维持反应体系的底物浓度和pH值。

对L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物不同添加量对732阳离子交换树脂-细胞GAD反应体系转化活性的影响进行考察，结果（图4）显示，当L-Glu/MSG固体混合物的添加量小于30 g/L时，随着添加量增加，732阳离子交换树脂的实验组和无732阳离子交换树脂对照组的GABA产量均显著上升。当L-Glu/MSG固体混合物添加量为30 g/L时，实验组GABA产量从（3.25±0.12）mmol提高到（4.57±0.11）mmol，提高了40.62%；对照组GABA产量从（2.29±0.08）mmol提高到（3.49±0.16）mmol，提高了52.40%；相对于既不添加732阳离子交换树脂也不添加L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物的转化反应结果（（2.29±0.08）mmol），添加732阳离子交换树脂及L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物30 g/L的实验组GABA产量（（4.57±0.11）mmol）提高了99.56%。

由图4可知，随着L-Glu/MSG固体混合物添加量增加，转化液的终pH值呈下降趋势，说明添加L-Glu/MSG固体混合物有助于维持催化体系的pH值，更有利于细胞GAD转化反应。当L-Glu/MSG固体混合物添加量超过30 g/L，实验组GABA产量却有所下降，原因尚不明。

随着L-Glu/MSG固体混合物的添加量增加，实验组相对于对照组的GABA增产率呈下降趋势，在0～45 g/L范围内，GABA增产率由41.92%降到了15.35%。说明L-Glu/MSG固体混合物对反应体系pH值的维持作用弱化了732阳离子交换树脂因稳定反应体系pH值所产生的促进细胞GAD转化活性的优势。然而，实验组相对于对照组GABA产量仍可提高15%以上，说明732阳离子交换树脂除了维持反应体系pH值的作用外，可能还存在其他促进细胞GAD转化活性的机制。

综上分析表明，在转化反应体系中添加30 g/L L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物，可稳定转化反应体系的pH值，提高细胞GAD转化活性，显著增加GABA的产量。因此在732阳离子交换树脂-GAD催化体系中，选择添加30 g/L的L-Glu/MSG固体混合物作为控制反应体系pH值的备用酸和备用反应底物。

图4 不同L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物添加量对732阳离子交换树脂-细胞GAD转化体系活性的影响Fig.4 Effect of the amount of L-Glu/MSG (2∶1) solid mixture on biotransformation activity of the complex system

3 讨 论

乳酸菌通过GAD催化L-Glu的α-羧基发生脱羧作用生成GABA，提高细胞微环境的pH值，抵抗酸性环境对其生长繁殖的不利影响，这是乳酸菌的耐酸机制之一[20-24]。基于在细菌中的作用，极大多数细菌的GAD在酸性条件下具有较高活性，在中性和碱性环境活性极其微弱或完全丧失[22,24-25]。图1表明，当pH值升高，GAD活性快速下降，适宜的反应pH值范围很窄。GAD对pH值的依赖性对屎肠球菌维持正常生理功能，抵抗代谢过程中的pH值急剧变化具有重要意义，然而却对屎肠球菌GAD的开发利用十分不利，在GABA生产过程中很难做到对pH值的精准控制。在生产过程中，为了提高设备利用率和减少成本，通常采用较高的酶蛋白或菌体进行生产，总GAD活性高，反应较激烈，pH值变化较大，采用缓冲液难于控制反应体系的pH值。同时高浓度的缓冲液对GAD活性或下游GABA的提取纯化均不利。采用无机酸（如盐酸、硫酸）调节反应体系pH值是目前常用的手段，但这种方法也容易产生大量的盐而造成GABA下游提取纯化困难。由于非均质固体酸容易分离和回收，是一种有效的、环境友好的控制pH值的手段，在乙酰化、烷基化、酰化、水解和脱水等化学反应中均有所应用[26-27]。为了减少盐的形成和酸的用量，Dinh等[28]在以大肠杆菌工程菌BL21（DE3）制备的纯GAD催化反应中采用强酸型阳离子交换树脂Amberlyst 15作为固体酸，利用离子交换的H+控制反应体系的pH值，结果转化率提高了13%～67%。理论上，732阳离子交换树脂可通过与反应体系的Na+、GABA或L-Glu解离的阳离子发生离子交换而释放H+，从而达到了控制反应体系pH值和减少反应体系盐的作用。然而，表1表明732阳离子交换树脂的加入会很快与体系的阳离子发生交换而改变反应体系的pH值，偏离屎肠球菌GAD的适宜反应pH值，说明反应体系存在的多种阳离子均可与732阳离子交换树脂发生交换，无法实现GABA与树脂H+对等交换而适时调节反应溶液pH值。虽然通过先以含L-Glu的pH 4.2、0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液平衡732树脂，再添加到反应体系，体系初始反应pH值可以稳定在设计的适宜反应pH值（表2），但经过平衡后，树脂携带的H+减少，对反应体系pH值的稳定作用也会减弱（图2）。表2结果表明在屎肠球菌细胞转化体系中添加未经L-Glu平衡的732阳离子交换树脂，转化活性较不添加树脂的对照组略有下降，说明732阳离子交换树脂在非GAD纯酶的细胞转化体系中并不能起到促进GAD活性作用，与Dinh等[28]在纯GAD反应系统中获得的结果并不一致。综上分析可见，在共反应体系中通过阳离子交换释放H+达到控制反应体系的pH值，从而促进GAD的转化活性，并不是阳离子交换树脂促进GAD活性的唯一机制。

图2和图4均表明反应液中仍有相当多L-Glu未转化，说明对照组较添加经L-Glu平衡的732阳离子交换树脂实验组的产量低，其原因并非是L-Glu底物不足所造成。

细胞转化反应过程中，由于细胞存在屏障，形成相对独立的微环境，对L-Glu与GABA存在传质阻力，不利于全细胞的催化过程。赵伟睿等[29]通过以二甲苯对表达重组GAD的工程菌BL21(DE3)-pET28a-gadB进行透性化处理，结果菌体表观催化活性提高了12.4 倍。L-Glu底物与GABA在细胞内外的浓度差也是传质速度的重要因素，经L-Glu平衡的732阳离子交换树脂所交换的L-Glu与转化生成的GABA发生交换，可维持转化液游离L-Glu浓度，减少转化液游离GABA浓度，加快L-Glu和GABA进出细胞的速度，从而提高GAD的催化效率，可能是732阳离子交换树脂促进细胞转化GAD活性的机制之一。同时，如果屎肠球菌GAD存在产物抑制效应，GABA经732阳离子交换树脂交换后，转化液中游离GABA浓度降低，将可缓解产物抑制作用。

斯晗[30]研究表明谷氨酸棒杆菌催化GABA分解代谢的γ-氨基丁酸转氨酶（GABA-T）和γ-氨基丁酸转氨酶-琥珀酸半醛脱氢酶偶联酶（GABA-T-SSADH）在pH 5.0以上时已具有催化活性，当pH值大于6.0时，酶活性快速升高。图2～4显示，反应体系的终pH值均已达到5.2以上，因此随着转化液游离GABA增加，可能会造成GABA-T或GABA-T-SSADH对GABA的代谢作用增强。GABA经732阳离子交换树脂交换后，转化液中游离GABA浓度下降，可减少GABA被代谢。

综上可知，732阳离子交换树脂促进细胞GAD转化活性的机制可能有多种途径，具体机制有待进一步探讨。

本实验结果表明，732阳离子交换树脂可显著促进屎肠球菌细胞GAD转化活性，提高GABA的产量，今后通过对732阳离子交换树脂-GAD复合体系的转化工艺进行改进，有望进一步提高GABA的产率，拓宽732阳离子交换树脂在生物合成领域的应用。研究结果在理论上对其他生物合成研究与开发也具有很好的参考意义。