IRX3基因在秦川牛不同组织中的表达分析

宁 越，吴 森，张 乐，昝林森,2

(1 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2 国家肉牛改良中心，陕西 杨凌 712100)

秦川牛是我国著名的地方黄牛品种，具有耐粗饲、抗逆性(病)强、肉质优的特点，但生长慢、产肉量低且脂肪沉积欠佳[1]。我国地方黄牛资源丰富，西北农林科技大学牛业团队一直致力于秦川牛肉用性状选育工作，利用常规育种手段及现代分子生物学技术，历经20余年，已成功选育出秦川牛肉用新品系，其生长速度、产肉性能均较秦川牛有显著提高。

IRX3基因是Iroquois同源盒基因家族的成员之一，具有较高的保守性，是调节脊索动物脂肪沉积的重要基因[2-3]。该家族的各成员在脊椎动物胚胎形成过程中参与许多调控作用[4]。有研究发现，IRX3是调控脂肪组织的重要因子，并对脂肪沉积有重要影响[5]。另有研究发现，敲除斑马鱼IRX3a基因后，胰腺饥饿素ε细胞(pancreatic ghrelin-producing epsilon cells)数量上升，胰岛素β细胞数量下降(insulin-producing beta-cells)，胰高血糖素α细胞(glucagon-producing alpha-cells)数量上升，表明胰腺中IRX3基因的功能与肥胖和Ⅱ型糖尿病有直接关联[6-9]。另外，人们原来一直认为人类肥胖在遗传上主要是由于FTO基因突变导致的，但实际上是由FTO基因内部的一些肥胖相关元件与位于基因组上较远位置的IRX3基因发生互作而导致的，因此IRX3很可能是一个具有肥胖功能的基因[10-12]。而FTO基因自身似乎只对肥胖产生周边效应[13-15]。

目前，有关IRX3基因的研究仍然较少，在非模式动物上的研究几乎没有。因此，本研究利用荧光实时定量技术，检测IRX3基因在秦川牛不同月龄不同组织中的表达情况，以揭示IRX3在秦川牛机体中的表达规律，为秦川牛的分子育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试组织与器官 供试材料包括3头秦川牛胎牛(妊娠3个月的胎儿)的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、肌肉(背最长肌)，3头6月龄秦川牛的心脏、肝脏、肺脏、大肠、小肠、肌肉(背最长肌)，3头24月龄秦川牛的心脏、肝脏、肺脏、大肠、肌肉(背最长肌)，以及6月龄、18月龄、24月龄、60月龄秦川牛的脂肪组织，所有组织器官均由西北农林科技大学国家肉牛改良中心种质资源库于-80 ℃保存。

1.1.2 主要试剂及仪器 Trizol试剂和总RNA提取试剂盒，TIANGEN®公司产品；天净沙RNase清除剂A型，北京天恩泽®公司产品；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒和SYBR®Primix ExTaqTMⅡ试剂盒，TaKaRa公司产品；7500 Real Time PCR仪，ABI公司产品。

1.2 牛组织总RNA的提取及反转录PCR

用Trizol法提取牛组织总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测法和分光光度计检测法对所提RNA的品质进行检测。将品质符合要求的组织总RNA用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒进行反转，反应得到的cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.3 IRX3表达量的实时荧光定量检测

1.3.1 引物设计 选用GAPDH、β-actin、B2M、Ubiquitin和18S rRNA 为内参基因，检测其在各待测组织中的表达情况，利用NormFinder和geNorm进行分析，通过计算稳定值来确定最适内参数量及最佳内参，结果显示GAPDH为最佳内参基因，因此选用GAPDH为内参进行试验。根据秦川牛IRX3的mRNA序列设计实时定量特异性引物，交由TaKaRa®公司合成；GAPDH引物由本实验室保存。引物相关信息见表1。

1.3.2 实时荧光定量技术 用SYBR®Primix ExTaqTMⅡ试剂盒进行实时定量PCR，反应体系为20 μL，其中SYBR®Primix ExTaqⅡ10 μL，上、下游引物各 0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板 2 μL，dH2O 6 μL。反应在7500 Real Time PCR仪(ABI公司产品)上进行，具体循环参数为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，循环40次。熔解曲线程序为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每个样品进行3次重复试验。

表1 IRX3和GAPDH的qRT-PCR引物Table 1 Primers of qRT-PCR of IRX3 and GAPDH

1.4 数据处理

用待测基因的Ct值减去对应的内参基因GAPDH的Ct值,即可得到每种组织的ΔCt值，在待测组织中选择一种组织作为参照(其表达量设定为1)，采用2-ΔΔCt法处理数据并分析相对表达量[16-17]，结果以“平均值±标准误”表示。

相对表达量用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 秦川牛胎牛IRX3基因的组织表达规律

以IRX3基因在肝脏中的表达量为参照，其在秦川牛胎牛8个不同组织中的相对表达量见图1。

图柱上标不同小写字母表示组织间差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示组织间差异极显著(P<0.01)。图2,3同Different lowercase letters mean significant difference among tissues at P<0.05,different capital letters mean extremely significant difference at P<0.01.The same for Fig.2 and Fig.3图1 秦川牛胎牛IRX3基因的组织表达规律Fig.1 mRNA expression of IRX3 gene in different tissues of Qinchuan fetal bovine

由图1可知，在所检测的组织中，肺脏IRX3基因的表达量最高，极显著高于其他组织(P<0.01)；其次是肾脏，其IRX3基因的表达量极显著高于除肺脏外的其他组织(P<0.01)；再次是心脏，其IRX3基因的表达量显著高于除肺脏、肾脏外的其他组织(P<0.05)；肝脏、脾脏、大肠、小肠和肌肉等组织中IRX3基因表达量极低。表明IRX3基因在秦川牛胎牛时期与肺脏和肾脏发育紧密相关。

2.2 6月龄秦川牛IRX3基因的组织表达规律

以IRX3基因在大肠中的表达量为参照，其在6月龄秦川牛6个不同组织中的相对表达量如图2所示。由图2可知，在所检测的组织中，肺脏IRX3基因的表达量最高，极显著高于其他组织(P<0.01)；其次是心脏，IRX3基因表达量显著高于除肺脏外的其他组织(P<0.05)；肝脏、大肠、小肠和肌肉中IRX3表达量很低。表明IRX3基因在秦川牛6月龄时对肺脏和心脏的发育有一定影响。

2.3 24月龄秦川牛IRX3基因的组织表达规律

以IRX3基因在肌肉中的表达量为参照，其在24月龄秦川牛5个不同组织中的相对表达量见图3。由图3可知，在所检测的组织中，肺脏中IRX3基因表达量最高，极显著高于其他组织(P<0.01)；其次是心脏和肝脏，其IRX3基因表达量均处于较高水平；大肠和肌肉中IRX3基因表达量很低。

图2 秦川牛6月龄犊牛IRX3基因的组织表达规律Fig.2 mRNA expression of IRX3 gene in different tissues of 6-month Qinchuan cattle

2.4 不同年龄秦川牛IRX3基因在相同组织中的表达规律

以IRX3基因在胎牛时期各组织中的表达量为参照，其在秦川牛不同发育阶段同一组织中的相对表达量如图4所示。由图4可知，在心脏和肝脏组织中，IRX3基因的表达量随着年龄的增长而持续增高，其中以肝脏的增长幅度最大，并且24月龄时的表达量极显著高于胎牛和6月龄时期(P<0.01)。对肺脏和大肠而言，IRX3基因在胎牛中的表达量较高，出生后在肺部的表达量有所下降但差异未达显著水平(P>0.05)，而在大肠中的表达量极显著降低(P<0.01)；之后随着年龄的增长，IRX3基因表达量在24月龄达到最高，极显著高于胎牛和6月龄时期(P<0.01)。各组织中只有肌肉组织IRX3基因在胎牛中的表达量最高，出生后表达量随着生长发育而极显著降低(P<0.01)。可见，IRX3基因在不同时期秦川牛同一组织中的表达量均有显著差异，推测其在秦川牛生长发育中有较为活跃的功能。

同一组织不同年龄阶段相比，图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)Different lowercase letters mean significant difference among age groups at P<0.05,and different capital letters mean extremely significant difference at P<0.01

2.5 IRX3基因在不同时期秦川牛脂肪组织中的表达规律

以24月龄脂肪组织中IRX3的表达量为参照，其他年龄段脂肪组织中IRX3基因的表达情况如图5所示。由图5可以看出，随着年龄的增长，秦川牛脂肪组织中IRX3基因的表达量呈先升高后降低最后再升高的变化趋势，18月龄时表达量最高，极显著高于其他年龄段(P<0.01)；其次是6月龄，IRX3表达量极显著高于24～60月龄(P<0.01)。

不同年龄相比，图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)Different lowercase letters mean significant difference among age groups at P<0.05,and different capital letters mean extremely significant difference at P<0.01图5 秦川牛IRX3基因在脂肪组织中的表达规律Fig.5 mRNA expression of IRX3 gene in fat tissue of Qinchuan cattle

3 讨 论

我国地方黄牛资源丰富，但多为役肉或肉役兼用型，产肉量较低，脂肪沉积欠佳[1]。如何依靠地方品种资源和生物技术手段加快黄牛遗传改良，积极培育优质高产肉牛品种，是我国肉牛产业和广大科技工作者面临的重要课题。研究发现，IRX3基因在调节脊索动物生长发育、脂肪沉积等方面有重要作用[2-3]。因此，研究IRX3基因在秦川牛组织中的表达情况，对利用现代分子育种方法进行肉脂品质改良有重要的指导意义。

IRX3基因作为Iroquois同源盒基因家族的成员之一，具有较高的保守性。该家族的各成员在脊椎动物胚胎的形成模式中参与许多调控作用[4]。Dankel等[18]对通过外科手术去脂(腹部脂肪)的肥胖患者术前和1年后及正常偏瘦人的相关基因进行检测后发现，手术后IRX3、IRX5等基因显著上调，从而发现IRX3是调控脂肪组织的重要因子。

本研究发现，在秦川牛胎牛、6月龄、24月龄时，IRX3基因在肺脏组织中的表达量始终最高，并在成年牛时期达到最高；心脏组织的IRX3表达量也处于较高水平，并随牛生长发育阶段的推进而增大，因此推测该基因与心脏的发育有着密切联系，这点与已有的研究结果即IRX3可以影响心脏功能相一致[19-23]。IRX3基因在秦川牛肝脏、脾脏、大肠、小肠和肌肉中的表达量都处于较低水平。

在脂肪组织中，IRX3基因的表达情况与生长发育情况一致，在6到18月秦川牛快速生长时期极显著高于其他时期，并且表达量随年龄增加而增长；而在18～24月龄秦川牛生长变得缓慢，IRX3基因表达量也显著降低。分析发现，IRX3基因在脂肪组织中的表达量与牛生长速度正相关，表明IRX3基因在秦川牛发育过程中与脂肪沉积有密切联系。