13-甲基十四烷酸对大鼠局灶性缺血脑组织的保护作用

何宏星， 翁绳美， 胡 潇， 余 涓

13-甲基十四烷酸(13-methyltetradecanoicacid, 13-MTD)，也称为13-甲基肉豆蔻酸，是一种末端支链的中长链饱和脂肪酸，可从大豆发酵产物中提取，也可人工合成，天然存在于细菌和某些真菌的细胞膜上，是细菌胞膜的重要成分，可通过调节膜的组成而影响细胞的功能[1]。Faung等发现，13-MTD可有效抑制某些细菌感染导致的出血及血小板聚集引起的有关疾病[2]。本课题组既往实验证实，13-MTD可明显缩小脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)后脑梗死的体积，改善神经功能缺损程度，减轻脑水肿，保护血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的结构和功能，其机制与13-MTD的稳膜、抗炎、抗氧化、抑制环氧化酶(cycloxygenase-2, COX-2)/5-脂氧酶(5-lipoxygenase,5-LO)等作用均有关[3-5]。在此基础上，本研究主要探讨13-MTD对大鼠不同持续时间脑缺血所导致的神经功能损伤以及脑水肿的保护作用。

1 材料与方法

1.1动物、药品与试剂 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠75只，体质量230～270 g，由福建医科大学实验动物中心提供[SCXK(闽)2012-0001]。13-MTD系福建医科大学药学院合成(纯度99.8%)，以脂质体包裹(含量10 mg/mL)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)分析纯(上海化学试剂公司)，磷酸盐缓冲液配制，避光低温贮存；其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1动物分组 75只大鼠随机分为假手术(Sham)组、溶媒对照(Vehicle)组及13-MTD 40(M40)，80(M80)，120 mg/kg(M120)干预组；每组又按脑缺血时间分为6，12，24 h组，共15组，每组5只。13-MTD各剂量组插入线栓前30 min，分别于尾静脉注射13-MTD 40，80及120 mg/kg；假手术组不插入线栓；溶媒对照组则给予等体积空白脂质体。各组大鼠均于相应缺血时间点进行神经功能缺失评分，评分后根据需要处死取样。

1.2.2模型制备 线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)[6]。动物术前禁食12 h，自由饮水。10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔麻醉，颈部正中切口，钝性分离颈总、颈内及颈外动脉。在距离颈总动脉分叉约1 cm处结扎近心端，电凝远心端。用无创小动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉远心端，在颈外动脉残端距颈总动脉分支约3 mm处剪一小口，将线栓自颈外动脉插入颈内动脉，打开颈内动脉上的动脉夹将线栓向前推进(18.5±0.5)mm(自分叉处计)，结扎固定线栓，松开颈总动脉上的动脉夹，缝合切口。MCAO模型成功的标志为动物清醒后出现以左前肢为主的偏瘫和行走时的追尾症。

1.2.3神经功能缺失评分 参照Longa建立的神经功能缺失评分标准，判断模型是否成功[7]。0分：无明显神经缺损症状，活动正常；1分：垂直提起时不能完全伸展对侧前肢(轻度局灶性神经功能缺损)；2分：行走时身体向偏瘫侧转圈(中度局灶性神经功能缺损)；3分：行走时向偏瘫侧倾倒(重度局灶性神经功能缺损)；4分：不能自发行走或有意识障碍。1～3分者为手术成功的标志，弃去手术中出血过多的动物。

1.2.4脑梗死体积与脑水肿程度测定 参照文献[8]的方法，于相应的缺血时间迅速断头取脑，将脑组织置于生理盐水冰盘上行冠状切片，切4刀成5片。迅速将脑片置2%的TTC中避光染色，37 ℃温孵30 min，将脑片置10%福尔马林中避光保存过夜。将固定后的染色结果拍照输入计算机，利用AutoCAD图像处理软件，计算出梗死区域(白色)占大脑总体积的百分比作为梗死灶体积，并用同样的方法计算出缺血侧脑水肿程度：

脑水肿(%)=(缺血侧脑半球体积-非缺血侧脑半球体积)/非缺血侧脑半球体积×100%

1.2.5脑干湿重测定脑含水量 于相应缺血时间处死大鼠，迅速取出脑组织，切成等厚度的5片，准确称量湿重后，将脑片放入烤箱内于110 ℃烤24 h，至恒重后，取出称量脑片干重。

脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%

1.2.6BBB通透性检测 按Belayev法以EB作为示踪剂，检测BBB的损伤程度[9]。动物处死前2 h，尾静脉注射2%的EB 2 mL/kg，大鼠眼球结膜、四肢等处显示蓝色，表示注入成功。用1%肝素生理盐水经左心室灌流，然后迅速取损伤侧脑组织，称取湿重后置入装有3 mL甲酰胺的匀浆器，54 ℃水浴孵育24 h，让组织中的EB充分溶解在甲酰胺溶液中。将溶有EB的甲酰胺溶液过滤，用酶标仪(λ=630 nm)测定各组的光密度值。根据标准曲线，计算出EB含量，依据所测得的浓度计算出BBB对EB的通透率，以每克湿重脑组织内所含EB的量(μg/g)表示。

2 结 果

2.1神经功能缺失评分 各组大鼠于脑缺血6，12及24 h进行神经功能缺失评分比较。假手术组为0分。溶媒对照组于缺血6，12，24 h均有不同程度的神经功能缺失症状，表现为右侧眼睑下垂，提尾悬空时，左前肢内收及躯干向左侧扭转，运动时出现向左侧转圈式行走为追尾征，神经功能缺失严重时向左侧倾倒，各缺血时间点的神经功能评分差别有统计学意义。与溶媒对照组比较，13-MTD各剂量组于各缺血时段的神经功能缺失评分均降低(均低于1分)，无明显神经缺损症状，活动较为正常；在6 h时段，神经功能缺失评分较低，且在80 mg/kg以下存在剂量依赖性，以M80组改善最为明显，M120组未表现更好的效果(P<0.01，图1)。

n=5. 13-MTD：13-甲基十四烷酸； MCAO：大脑中动脉闭塞. 与溶媒对照组比较，☆：P<0.01；13-MTD各剂量组两两比较，△：P<0.01.图1 13-MTD对MCAO大鼠不同缺血时间神经功能的影响Fig 1 Effect of 13-MTD on neurological deficit score in different groups after 6 h,12 h and 24 h MCAO in rats

2.2脑梗死面积 经2%的TTC染色，假手术组各缺血时间点的脑片全红，色泽均匀，表明无损伤；溶媒对照组中，6 h组缺血侧脑组织皮层部分有白色梗死灶，12 h组白色梗死灶明显，累及整个缺血侧的大脑皮层，24 h组白色梗死灶最为明显，累及整个缺血侧脑半球，并伴有轻度糜烂；13-MTD各剂量组缺血侧脑组织外观均有所改善，白色梗死灶范围均有所减少(P<0.01)，尤其以M80组治疗效果最好(P<0.05)，各剂量组脑梗死面积比较差别均有统计学意义(图2)，以缺血6 h的脑梗死面积比例最低，而缺血12和24 h的白色梗死灶出现一定程度的减少，但效果不如6 h组。

2.3脑组织水肿程度 脑缺血6，12及24 h后，损伤侧脑水肿程度明显强于对侧，脑体积增大且含水量增加，至24 h时损伤最重。各缺血时间点，假手术组大脑体积均匀；溶媒对照组两侧脑组织体积不均等，缺血侧脑组织体积稍大，水肿明显(P<0.01)；与溶媒对照组比较，13-MTD各剂量组脑组织水肿减轻(P<0.01)，以M80组效果最好(P<0.01)，各剂量组之间差别也有统计学意义(图3A)。

2.4脑含水量 与假手术组比较，溶媒对照组各缺血时间点的脑组织含水量均明显增加(P<0.01)，以24 h组最严重(P<0.001)；与各时间点溶媒对照组比较，各剂量13-MTD组脑组织含水量均明显下降(P<0.05)，以M80组效果最好(P<0.01，图3B)；在6 h时，脑组织含水量下降较为明显，12和24 h的脑组织含水量虽有所下降，但与6 h比较并不是很理想。

n=5. A：缺血6 h; B:缺血12 h; C:缺血24 h； D：不同缺血时间的脑梗死面积比例. 1：假手术组； 2：溶媒对照组； 3～5：M40, M80, M120组. 与溶媒对照组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01；与M80组比较，△：P<0.05，△△：P<0.01.图2 13-MTD对MCAO大鼠不同缺血时间脑梗死面积的影响Fig 2 Comparison effect of 13-MTD on infarct size in different groups after MCAO 6 h, 12 h and 24 h in rats

n=5. A:脑组织水肿程度； B：脑含水量. 与溶媒对照组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01；与M80组比较，△△：P<0.01.图3 13-MTD对MCAO大鼠不同缺血时间脑组织水肿程度及脑含水量的影响Fig 3 Effect of 13-MTD on cerebral edema， dry and wet weight in different groups caused by cerebral ischemia after MCAO 6 h, 12 h and 24 h in rats

2.5BBB通透性的改变 在脑缺血6，12及24 h后，肉眼可见脑组织有蓝色物质渗出，并随时间推移蓝色区域扩大，提示脑缺血后BBB损伤，有EB渗出，至缺血24 h时蓝色区域最大。各缺血时间段，假手术组脑片肉眼基本看不见蓝色渗出；与假手术组比较，溶媒对照组于各缺血时间点均可见明显的蓝色区域(P<0.01)；与溶媒对照组比较，13-MTD各剂量组脑组织EB渗出明显减少(P<0.05)，以M80组效果最好(图4)。

3 讨 论

脑缺血中风在脑血管疾病中以其高死亡率和严重临床症状为特点，缺血后脑水肿的形成使神经功能损伤加速恶化，颅内压升高，脑血流量减少，最终导致脑疝和患者死亡[10]。本研究采用提前30 min预给药，证明13-MTD可改善大鼠MCAO的神经功能缺损评分，缩小脑梗死体积，减轻脑水肿。本课题组以往研究证明，13-MTD对CIRI有缓解作用，本研究显示，13-MTD对持续长时间缺血脑组织的功能也有保护作用。

n=5. A：缺血6 h; B:缺血12 h; C:缺血24 h； D：不同缺血时间的脑组织EB含量. 1：假手术组； 2：溶媒对照组； 3～5：M40, M80, M120组. 与溶媒对照组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01；与M80组比较，△△：P<0.01.图4 不同缺血时间13-MTD对不同干预组EB含量的影响Fig 4 Effect of 13-MTD on the content of EB after MCAO 6 h, 12 h and 24 h in rats

本实验采用经典的线栓法阻断大鼠右侧大脑中动脉(middle cerebral artery, MCA)的血供来制作脑缺血模型。MCA主要供应颞叶、顶叶及基底节等处的血液，涉及调控运动的脑区。右侧MCA阻断后，使同侧运动调控区发生损伤，因皮层交叉支配致左侧肌无力，运动时左侧旋转，表现出典型的追尾征或左侧倾倒等症状。

实验过程中，大鼠脑缺血6，12及24 h后，白色脑梗死灶依次加重，位于手术同侧的额顶叶皮层、颞叶皮层和尾状核及壳核外侧部，与MCA支配的脑区域基本一致，同时神经功能缺失症状逐渐加重，评分逐渐升高。以40，80及120 mg/kg的13-MTD干预后，脑梗死体积明显缩小，且与神经功能缺失评分有一定的关联性，梗死体积缩小后，神经功能缺失症状也得到相应改善。3个剂量中，以80 mg/kg组的效果较好，且于缺血6 h时治疗效果最好，说明缺血时间的长短对疗效有直接影响，提示临床上治疗脑缺血性患者，应在治疗窗内尽快疏通血管，以改善预后。既往实验表明，13-MTD可以抑制线粒体肉毒碱棕榈酰转移酶1，促进细胞对葡萄糖的摄取和利用，使血糖降低，这种作用对缺血神经细胞改善能量代谢起作用，特别是保护缺血半暗带组织的功能可能起关键作用[11]。

研究表明，脑缺血损伤过程中，产生大量自由基攻击细胞膜的不饱和脂肪酸[12]，使膜脂质过氧化，造成膜结构破坏和钠泵功能障碍[13]；脂质过氧化也使膜不饱和脂肪酸减少，不饱和脂肪酸/蛋白质比例失调，致使膜的液态性及流动性降低，通透性增加，细胞外Ca2+内流增加，而缺血后ATP生成减少、乳酸堆积则加重了脑水肿，并与自由基之间相互作用，导致更为广泛的脑损伤。缺血前30 min，尾静脉注射不同剂量的13-MTD后，药物可通过血液循环快速到达脑部，并在短时间内达到血药浓度高峰，在缺血发生前对组织进行相应的保护，而13-MTD本身是一种末端支链饱和脂肪酸，可作为细胞膜成分嵌入膜脂质结构中，通过调节膜的组成而影响细胞功能，对细胞膜有稳定作用并改善能量代谢，从而发挥神经保护作用。13-MTD 40，80及120 mg/kg均可降低脑组织的含水量并减小脑水肿体积，以13-MTD 80 mg/kg疗效为佳。

实验研究13-MTD对BBB通透性改变的影响，伴随着EB的渗出，损伤侧脑组织存在一定的水肿现象，说明缺血损伤后BBB完整性的破坏与脑水肿的发生密切相关。缺血时间越长，EB的渗出量越多，脑水肿的程度越重。13-MTD 40，80及120 mg/kg均可降低不同缺血时间后EB的渗出，以80 mg/kg的改善效果最好。EB渗出减少的同时，损伤侧水肿也相应减轻，提示13-MTD可改善脑缺血后BBB的通透性，发挥神经保护作用。