塑化剂对慢性肾衰大鼠模型和腹膜透析患者腹膜纤维化调控因子TGF-β1/Smads表达的影响

罗来敏, 张桂玲

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是治疗终末期肾脏病(end stage renal disease，ESRD)的主要手段之一，PD液的包装材料主要是聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)。为改善PVC的性能，通常需要添加塑化剂，这类物质不能牢固结合，进入人体内可导致一系列的不良后果[1]。文献报道，塑化剂的主要成分邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate，DEHP)能刺激人腹膜间皮细胞合成和分泌细胞外基质，其机制可能是通过腹膜纤维化调控因子——转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)介导的[2]。为进一步验证DEHP对腹膜纤维化的影响和TGF-β1/ Smad蛋白家族(sma madrelated family,Smads)通路在其中的作用，笔者拟建立SD大鼠慢性肾衰模型，观察塑化剂的主要成分DEHP对肾衰大鼠腹膜纤维化关键因子TGF-β1/Smads表达的影响，并在人体中对比2种不同包装材料的腹透液对PD充分性、腹膜功能和腹透液中TGF-β1浓度的差别，探讨塑化剂与腹膜纤维化的关系和可能机制。

1 对象与方法

1.1对象 维持性PD时间1～6月且未发生过腹膜炎的维持性腹透患者16例，随机分为PVC组和非PVC组，其中PVC组男性5例，女性3例，年龄(48.9±14.7)岁(26～68岁)；非PVC组男性4例，女性4例，年龄(47.4±12.8)岁(27～63岁)。本研究通过医院伦理委员会批准。患者均签署知情同意书。

1.2材料 SD雄性大鼠30只，250～300 g[湖南长沙斯莱克景达有限公司，许可证号：SCXK(湘)2014-0004]。PVC包装PD液10袋(批号：G1408112，广州百特医疗用品有限公司)；DEHP标准液(纯度≥99%，上海将来实业股份有限公司)；正己烷(分析纯，西陇化工股份有限公司)；紫外分光光度计(UV-3200型，上海元析仪器有限公司)；人 TGF-β1酶联免疫分析试剂盒(上海酶研生物科技有限公司)；兔抗大鼠Smad3、兔抗大鼠Smad7、小鼠来源α-SMA多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(杭州贤至生物有限公司)；兔抗大鼠p-Smad2/3多克隆抗体(英国Abcam公司)；兔抗大鼠TGF-β1(美国Affinity Biosciences)；荧光(FITC)标记羊抗小鼠IgG、兔抗大鼠α-SMA抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司)；DEHP(美国Sigma公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen Life Techonology公司)；逆转录及实时荧光定量PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)试剂盒(北京全式金公司)；实时荧光定量PCR仪(7900型，美国ABI公司)。

1.3方法

1.3.1腹透液中DEHP的检测 从10袋患者即将使用的PVC包装PD液中各取10 mL，使用紫外分光光度计法得出吸光度，参照之前使用DEHP标准液绘制的标准曲线，计算出DEHP的平均浓度，按体质量进行校正后根据文献[3]中人和动物剂量转换方法确定大鼠腹腔注射的DEHP的量。考虑腹透患者的接触DEHP的时间远较大鼠模型长，干预浓度为计算出的DEHP给药量的1，10，100倍。

1.3.2腹透液中TGF-β1含量的测定 取患者入组时和3月后留置4 h后的腹透液10 mL，按人TGF-β1酶联免疫分析试剂盒说明书操作，测定腹透液中TGF-β1的含量。

1.3.3大鼠模型腹膜组织中TGF-β1/Smads表达的检测

1.3.3.1分组 30只SD雄性大鼠建立5/6肾切除肾衰模型，建模成功后随机分为5组，每组6只。(1)正常对照组(C组)：大鼠给予每日腹腔注射生理盐水20 mL·kg-1·d-1；(2)模型对照组(O组)：大鼠腹腔每日注射玉米油20 mL·kg-1·d-1。(3)低浓度DEHP组(L组)：大鼠腹腔每日注射20 mL·kg-1·d-1玉米油含0.5 mg/kg DEHP；(4)中浓度DEHP组(M组)：大鼠腹腔每日注射20 mL·kg-1·d-1玉米油含5 mg/kg DEHP；(5)高浓度DEHP组(H组)：大鼠腹腔每日注射20 mL·kg-1·d-1玉米油含50 mg/kg DEHP。于实验第28天处死动物取腹膜组织待检。

1.3.3.2壁层腹膜和肾脏组织学观察 组织常规脱水→透明→浸蜡→包埋→切片、烤片→脱蜡后，予苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，H-E)染色。观察壁层腹膜纤维化程度及腹膜厚度，肾脏纤维化程度。

1.3.3.3脏层腹膜α-SMA，TGF-β1，Smad3，Smad7和p-Smad2/3蛋白的表达 间接免疫荧光检测α-SMA；Western-blot方法检测α-SMA，TGF-β1，Smad3，Smad7和p-Smad2/3。

1.3.3.4脏层腹膜α-SMA，TGF-β1，Smad3，Smad7 mRNA的表达 采用实时荧光定量PCR方法检测。引物序列从GeneBank中查阅，根据引物设计原则，利用Primer Express2.0软件设计(表1)。cDNA的合成及实时荧光定量PCR参照全式金相关试剂盒操作程序进行。Rt-qPCR反应体系20 μL，反应条件：94 ℃ 30 s预变性→94 ℃ 5 s→60 ℃30 s共40个循环。最终数据以2-△△Ct进行分析。

表1 引物序列表

Rat TGF-β1：鼠转化生长因子-β1；Rat Smad3：鼠信号传导蛋白Smad3；Rat Smad7：鼠信号传导蛋白Smad 7；Rat α-SMA：鼠α平滑肌肌动蛋白；Rat GAPDH：鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶.

1.3.4PD患者尿素清除指数(urea clearance index，KT/V)、肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)检测和腹膜平衡试验 参照文献[4]方法，在入组前和入组3月后留取相应的血液、尿液和腹透液标本进行检测计算。

2 结 果

2.1腹透液中DEHP的含量 腹透液中DEHP的平均浓度为460.4 μg/L，按患者体质量计算平均每天接触量为0.07 mg/kg，根据文献[3]人和动物剂量转换方法得出大鼠腹腔注射的浓度约为0.5 mg/kg，故确定的大鼠模型DEHP腹腔注射剂量为0.5，5，50 mg/kg(表2)。

2.2受试者KT/V,Ccr及血尿素氮/腹透液尿素氮比值[blood urea nitrogen/peritoneal dialysis fluid urea nitrogen ratio，D/P(Urea)]、腹透液中TGF-β1的含量 入组时、3月后2组患者组间和组内KT/V，Ccr及D/P(Urea)比较，差别均无统计学意义(P>0.05)；PVC组3月后腹透液中TGF-β1浓度较入组时明显升高(P<0.05)；3月后非PVC组腹透液中TGF-β1浓度较PVC组明显降低(P<0.05，表3)。

表2 腹透液中DEHP的检测结果

DEHP：邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯.

2.3大鼠肾脏和腹膜形态学改变 H-E染色显示：5/6肾脏切除大鼠肾脏病理可见肾小球系膜细胞和基质弥漫增生，局灶节段性中-重度加重，肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性，多灶状萎缩，肾间质多灶状淋巴、单核细胞浸润伴纤维化明显，小动脉管壁增厚，玻璃样变，参考马林林等的文献[5]，表明造模成功。3月后，L,M,H组腹膜较C,O组腹膜增厚，间皮细胞增生明显，间质中纤维母细胞增生，伴炎症细胞浸润。

A：正常对照组；B：模型对照组；C：低浓度DEHP组；D：中浓度DEHP组；E：高浓度DEHP组；F：大鼠肾脏病理. DEHP：邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯.图1 大鼠肾脏和腹膜组织病理学变化Fig 1 Pathological changes of renal and peritoneal tissue in rats

A：正常对照组；B：模型对照组；C：低浓度DEHP组；D：中浓度DEHP组；E：高浓度DEHP组. 图中蓝色表示细胞核，红色标记a-SMA，白色箭头所示为a-SMA(免疫荧光 ×400). DEHP：邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯.图2 大鼠腹膜组织a-SMA的表达Fig 2 Expression of a-SMA in rat peritoneal tissue

2.4免疫荧光显示α-SMA在大鼠脏层腹膜组织的表达 正常腹膜组织内α-SMA表达较少，在使用含DEHP的腹透液后，α-SMA表达明显增加，不同浓度DEHP间，α-SMA表达无差别。免疫荧光可见α-SMA主要表达于细胞质。

表3 受试者KT/V,Ccr，D/P(Urea)及腹透液中TGF-β1的含量

PVC:聚氯乙烯；KT/V：尿素清除指数；Ccr：肌酐清除率；D/P(Urea)：血尿素氮/腹透液尿素氮比值；TGF-β1：转化生长因子-β1. PVC组3月后与入组时比较，★：P<0.05；非PVC组3月后与PVC组比较，◆：P<0.05.

2.5TGF-β1，Smad3，Smad7，p-Smad2/3及α-SMA在大鼠腹膜组织的表达 正常腹膜组织内TGF-β1，Smad3，p-Smad2/3及α-SMA有微弱的基础表达。使用含DEHP的透析液后，表达明显增加(P<0.05)；不同浓度的DEHP之间比较，表达差别无统计学意义。L，M，H组与C，O组比较，Smad7的蛋白及mRNA的表达下调(P<0.05，图3，4)。

3 讨 论

PD设备简单，性价比高，临床预后不断改善，成为许多国家和地区ESRD患者的首选[6-8]。2015年费森尤斯公司发布的医疗质量年度报告统计全球的腹透患者已超过272 000人[9]。但是PD患者的生存率并不乐观，Mujais等分析了超过40 000例美国的PD患者，发现4年的生存率仅为56%左右，而技术生存率更是只有47%[10]。当前限制PD患者长期技术生存的重要原因之一是腹膜纤维化导致的腹膜超滤功能丧失[10]，这类患者的死亡率也明显高于其他腹透患者[11]。腹透液的非生物相容性是主要原因[12]。包装材料中DEHP也可能扮演着主要角色。本研究测得腹透液中DEHP的平均浓度为460.4 μg /L，与文献报道的350～460 μg/L一致[13]，故以该DEHP的平均浓度为剂量参考对慢性肾衰大鼠模型进行干预。

TGF-β1是多种组织器官的重要促纤维化因子，主要是通过信号蛋白Smad2/3的活化发挥作用。腹膜炎大鼠模型和腹膜纤维化大鼠模型中均发现腹膜组织中TGF-β1/Smads表达的上调[14-17]，表明TGF-β1/Smads是腹膜纤维化的关键因子。本研究发现，DEHP组腹膜组织中TGF-β1，Smad3及p-Smad2/3在蛋白和RNA水平均较对照组上调，表明DEHP能刺激腹膜组织上调表达成纤维因子TGF-β1并激活Smads通路，而DEHP组中成纤维样细胞表型标志物α-SMA表达的增加进一步提示腹膜纤维化的启动；不同DEHP浓度对TGF-β1/Smads通路的活化程度无统计学差别，这与Fracasso等的研究一致[13]，提示这种激活可能为非剂量依赖性或日常的接触剂量就足以完全激活该通路。腹膜组织病理学检查发现：与对照组比较，DEHP组可见大鼠腹膜组织表现出间皮细胞异常和纤维化趋势， DEHP引起腹膜间皮细胞形态和功能的异常，激活炎症反应，破坏腹膜组织正常结构，这是腹膜功能受损的表现[18]，说明PVC包装腹透液中所含的DEHP可致腹膜间皮细胞结构和功能发生变化，启动纤维化改变，其机制可能是激活组织纤维化关键信号TGF-β1/Smad通路。

Smad7可以抑制Smad2/3的活化、Smad3/4异源复合物的形成及核转位，阻断TGF-β1/Smad信号通路的活化[19-21]。本研究结果提示，Smad7同其他蛋白一样，在对照组有一定量的基础表达预防腹膜组织纤维化。当TGF-β1激活Smad2/3蛋白时，Smad7的表达未随之上调，而是下调，表明DEHP在激活TGF-β1及Smad2/3等促纤维化因子的同时也能抑制抗纤维化因子Smad7的表达。研究表明，基因转染Smad7上调表达后，可以明显抑制大鼠腹膜组织局部TGF-β1/Smad的表达和信号蛋白的活化[20-23]。这些结果可能预示着TGF-β1/Smad通路中促纤维化因子和抗纤维化因子之间的比例失衡对纤维化的进展意义更大，提示将来应用Smad7防治腹膜纤维化可能起到重大作用。

在人体研究中，2组受试者在代表PD充分性的指标KT/V、Ccr和代表腹膜功能的D/P值上，组间比较和组内比较均无统计学差别，表明使用含DEHP的PD液透析3月不会对PD的充分性和腹膜功能产生明显的影响。3月后PVC组腹透液中TGF-β1明显高于非PVC组。Narikiyo等以不同浓度的DEHP干预SD大鼠腹膜间皮细胞，24 h后分析细胞培养液离心后的上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， LDH)的活性，显示在常规浓度下PD液中的DEHP不会对腹膜间皮细胞产生急性细胞毒性作用，同时也指出DEHP对腹膜的长期影响还需要进一步的研究[24]。笔者认为，常规浓度的DEHP可激活腹膜组织纤维化因子，启动组织纤维化进程，但该过程是缓慢而持久的，可能需要较长时间才能引起腹膜组织在结构上出现有临床意义的改变。

C组：正常对照组；O组：模型对照组；L组：低浓度DEHP组；M组：中浓度DEHP组；H组：高浓度DEHP组. DEHP：邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯. 与L，H，M组比较，△：P<0.05.图3 大鼠腹膜组织TGF-β1，Smad3,Smad7，p-Smad2/3和α-SMA蛋白相对表达量Fig 3 The relative expression of TGF-beta 1, Smad3, Smad7, p-Smad2/3 and α-SMA protein in the peritoneal tissue of rats

C组：正常对照组；O组：模型对照组；L组：低浓度DEHP组；M组：中浓度DEHP组；H组：高浓度DEHP组. DEHP：邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯. 与L,H,M组比较，△：P<0.05.图4 各组大鼠腹膜组织TGF-β1，Smad3,Smad7和α-SMA mRNA相对表达量Fig 4 The relative expression of TGF-β1, Smad3, Smad7 and α-SMA mRNA in the peritoneal tissue of rats

受实验室条件、经费、时间等条件的限制，笔者未能开展非PVC包装PD液对PD患者长期腹膜功能的影响的研究。据报道，由解放军三零一医院陈香美院士牵头联合青岛华仁医药有限公司正在进行一项非PVC包装PD液对长期PD患者有效性和安全性的多中心研究[25]，期待这个研究能带来新的结论。综上所述，PVC包装腹透液中的塑化剂可以激活腹膜组织纤维化进程，可能是通过TGF-β1/Smad信号通路介导的，但要产生影响腹膜功能的变化可能需要较长时间，使用非PVC包装腹透液有可能改善PD患者长期技术生存率。