林蛙卵黑色素的理化性质及其抗氧化活性研究

吴世玉，孟祥敏，刘俊梅，王丹洋，周琪，郑常领

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

中国林蛙（Rana temporaries chensinensis Da-vid）俗称田鸡、哈士蟆，属两栖纲、无尾目、蛙科、林蛙属，主产于我国东北地区。中国林蛙体内富含蛋白质、糖类以及多种维生素和激素等营养成分[1]，具有重要的保健功能[2]。长白山地区林蛙沟系就达到2 100多条，占全省总量的四分之一作用，养殖面积超过148万公顷，年产林蛙油超过30 t，其副产物林蛙卵超过35 t。林蛙卵是林蛙油生产过程中的副产物之一，林蛙卵的年产量大且未能得到充分利用逐渐得到关注[1]。目前，关于林蛙卵油、林蛙多糖和林蛙卵蛋白的报道较多，林蛙卵油具有抗惊厥[3]、抗焦虑[4]和调节血脂[5]等作用；林蛙卵多糖具有抗肿瘤[6]、抗氧化[7]、降血糖[8]、降血脂[9]等作用；林蛙卵蛋白具有抗疲劳[10]、抗癌[11]等作用。而关于林蛙卵黑色素的报道较少。

近些年的研究发现，黑色素具有一系列功能活性，Tu等[12]研究表明从乌骨鸡肌肉中提取的黑色素具有很强的DPPH自由基清除能力；Manning等[13]报道黑色素可以抑制艾滋病病毒的增殖；Sava等[14]研究发现从红茶叶中提取的黑色素具有免疫调节功能。本研究以林蛙卵为原料，采用酶水解结合碱液除蛋白的方法提取林蛙卵黑色素，通过对林蛙卵黑色素溶解性试验、紫外光谱扫描、红外光谱扫描、元素含量测定和体外抗氧化试验，为林蛙卵黑色素进一步的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

鲜林蛙卵：国药（延边）林蛙生物科技有限公司。

1.1.2 试剂

丙酮、己腈、石油醚、乙醚、无水乙醇、乙醇、乙酸、甲酸、甲醇、己烷、氯仿、氢氧化钠等均为分析纯试剂：南京化学试剂有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力1 000 U/mg）：北京鼎国生物技术有限责任公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2，6-2 tertiary butyl-4-methyl phenol，BHT）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）均为分析纯：美国Sigma公司；甲硫氨酸、氮蓝四唑、核黄素均为分析纯：上海惠兴化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器

SY11-Ni水浴锅：北京市长风仪器仪表公司；3K15高速冷冻离心机：美国Sigma公司；CHA-S恒温振荡器（国华企业）、UV-2802紫外分光光度计：Agilent Technologies Co.Ltd.；FT-IR200傅立叶变换红外光谱仪：天津金贝儿科技有限公司；Elementar Vario EL III元素分析仪：德国Elementar公司；LECO CS-400碳硫测定仪：美国力可公司。

1.2 方法

1.2.1 林蛙卵黑色素的提取

参照朱方等[15]的方法，略作修改。具体步骤为：取鲜林蛙卵，去筋膜，清洗干净，冻干，用万能粉碎机进行粉碎，取林蛙卵粉100 g，加入300 mL蒸馏水，0.3%的木瓜蛋白酶，（58±1）℃酶解 2 h，离心 30 min（转速为9 500 r/min），沉淀用蒸馏水洗涤3次，加入丙酮进行脱脂，脱脂后的样品用蒸馏水洗涤3次，脱脂工艺重复一次，离心30 min（转速为9 500 r/min），得到粗品林蛙卵黑色素。

1.2.2 林蛙卵黑色素的分离

林蛙卵中蛋白的含量为16.8%[16]，而且林蛙卵黑色素与林蛙卵中的部分蛋白质结合紧密，因此脱除蛋白质是纯化林蛙卵黑色素的关键。称取20 g粗品林蛙卵黑色素，加入0.1 mol/L NaOH溶液，400 mL，40℃条件下水浴加热1.5 h，离心30 min（转速为9 500r/min）。沉淀透析24 h去除盐离子，分别用石油醚、乙醇和蒸馏水洗涤3次，冷冻干燥，即得到林蛙卵黑色素。

1.3 林蛙卵黑色素的理化性质

1.3.1 林蛙卵黑色素溶解性试验

准确称取10 mg林蛙卵黑色素，分别加入10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液、蒸馏水、丙酮、己腈、石油醚、乙醚、无水乙醇、乙醇、乙酸、甲酸、甲醇、己烷、氯仿等溶液中，利用漩涡振荡器充分混合均匀，观察林蛙卵黑色的溶解情况，再将试管置于100℃水浴中加热20 min，观察其溶解情况。

1.3.2 紫外可见光谱扫描

准确称取一定质量的林蛙卵黑色素，用0.1 mol/L NaOH溶解，配制成浓度为0.1、0.2、0.4 mg/mL的林蛙卵黑色素溶液。在100℃水浴的条件下加热至完全溶解。于200 nm～800 nm波长下扫描。

1.3.3 林蛙卵黑色素元素组成

根据Tu等[12]的方法，根据GB/T 19143-2017《岩石有机质中碳、氢、氧元素分析方法》，采用元素分析仪（elementar vario，EL）测定林蛙卵黑色素中的 C、H、O、N含量；根据GB/T 19145-2003《沉积岩中总有机碳的测定》，采用碳硫测定仪（LECO CS-400）测定林蛙卵黑色素中的S含量。

1.3.4 林蛙卵黑色素傅里叶红外光谱扫描

采用溴化钾压片法，按质量比1∶200加入林蛙卵黑色素和溴化钾，研成细粉进行压片。在500 cm-1～4 000 cm-1范围内测定其FT-IR吸收光谱。

1.4 林蛙卵黑色素的抗氧化活性

1.4.1 DPPH自由基清除能力

参照Chen等[17]的方法，略作修改，准确称取一定质量的林蛙卵黑色素，配制成浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL 和 4.0 mg/mL 的样品溶液，分别取1 mL 样品溶液、2mL 2×10-4mol/L 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）溶液和2 mL 95%乙醇溶液加入到试管中，摇匀，在25℃下反应30 min，在517 nm处测定其吸光度（Ai），将1 mL样品溶液和4 mL 95%乙醇溶液混合均匀并测定其吸光度（Aj），将2 mL DPPH溶液和3 mL 95%乙醇溶液混合均匀，测定其吸光度并记录（Ac），BHT做阳性对照。按照下面公式计算DPPH清除率。

1.4.2 超氧阴离子清除能力

准确称取一定质量的林蛙卵黑色素，分别配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL 和 4.0 mg/mL 的样品溶液。按照Martinez等[18]的方法，分别取0.5 mL样品溶液、7.5 mL 磷酸盐缓冲溶液（pH 7.8，50 mmol/L）、1 mL 390 mmol/L 甲硫氨酸、1 mL 30 μmol/L 核黄素、1 mL 1.5 μmol/L EDTA和 0.5 mL 2.25 mmol/L氮蓝四唑加入到试管中并混合均匀，将混合溶液在室温下光照10 min后，立刻避光于560 nm处测定其吸光度（A1），以不光照做为对照组（A2），BHT为阳性对照组，按照下面公式计算超氧阴离子清除率。

1.4.3 羟自由基清除能力

准确称取一定质量的林蛙卵黑色素，分别配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL 和 4.0 mg/mL 的样品溶液。羟自由基清除能力采用北京鼎国生物技术有限公司的试剂盒，进行测定。BHT为阳性对照组，按照下面公式计算羟自由基清除率，其中A1为空白对照组吸光值，A2为样品吸光值。

2 结果与讨论

2.1 林蛙卵黑色素溶解性试验结果

林蛙卵黑色素在不同溶剂中的溶解性见表1。

表1 林蛙卵黑色素在不同溶剂中的溶解性Table1 Solubility of melanin from ovum of Rana chensinensis

由表1可知，林蛙卵黑色素在乙醇、乙酸、甲酸、甲醇、己烷、氯仿等有机溶剂和无机溶剂中是不溶的。林蛙卵黑色素在25℃，0.1 mol/L NaOH溶液中不溶，100℃水浴加热20 min后，开始溶解，这与报道的红茶叶黑色素[12]和乌骨鸡黑色素[14]的溶解性一致。

2.2 林蛙卵黑色素的紫外可见光谱扫描结果

不同浓度的林蛙卵黑色素的紫外可见光谱（200 nm～800 nm）见图1。

图1 林蛙卵黑色素紫外光谱图Fig.1 UV-VIS spectra of the melanin from ovum of Rana chensinensis

3种浓度的林蛙卵黑色素在扫描范围内（200 nm～800 nm）出现了一致的吸收变化规律，林蛙卵黑色素在紫外区域都有强烈的吸收，并且伴随波长的逐渐增加，吸光度呈现下降的趋势，这是黑色素最明显的特征之一，这种现象是由于黑色素的高度共轭所致。林蛙卵黑色素在280 nm处有一肩峰。这个特征与Cheng等[19]、Wang等[20]和Selvakumar等[21]的结果十分相似。而在280 nm处一般是蛋白质的特征吸收峰。因此，推测这个肩峰可能是与林蛙卵黑色素紧密结合的蛋白质的特征吸收峰。

2.3 林蛙卵黑色素元素组成结果

Ito S等[22]提出的合成真黑色素和棕黑色素的S∶N分别为0.01和0.46，林蛙卵黑色素各组分的元素组成见表2。

表2 林蛙卵黑色素各组分的元素组成Table2 Elemental composition analytical data of melanin from ovum of Rana chensinensis

由表2可知，林蛙卵黑色素的S∶N为0.05，这表明林蛙卵黑色素主要含有真黑色素。林蛙卵黑色素的C∶N为10.04，明显高于合成真黑色素和棕黑色素的C∶N，这说明林蛙卵黑色素含有脂肪族，同时林蛙卵黑色素的O∶N为3.70，也略高于合成真黑色素和棕黑色素，这说明林蛙卵黑色素含有更多的羧基集团。

2.4 林蛙卵黑色素的傅里叶红外光谱扫描结果

林蛙卵黑色素的红外色谱见图2。

图2 林蛙卵黑色素的傅里叶红外光谱图Fig.2 UV-VIS spectra of melanin from ovum of Rana chensinensis

由图2可知，在3 361.9 cm-1处有一个宽峰，这是由OH和NH2基团伸缩振动引起的；1 643.4 cm-1处吸收峰为芳香族C=C或C=N的弯曲振动及C=O的不对称伸缩振动形成的，说明可能存在-COOH；1 446.6 cm-1处吸收峰为氨基酸中脂肪族C=C弯曲振动形成；1 373.3 cm-1处吸收峰为氨基酸中的C-N伸缩振动。603.7 cm-1处吸收峰是由苯环形成的。根据以上所分析的特征峰，可初步将林蛙卵黑色素归为真黑色素，另外，林蛙卵黑色素中仍然含有一定的氨基酸。

2.5 DPPH自由基清除能力结果

研究采用林蛙卵黑色素对DPPH自由基清除50%，即IC50进行对样品抗氧化活性评价见图3。

图3 林蛙卵黑色素和BHT清除DPPH自由基能力Fig.3 DPPH radical-scavenging of melanin from ovum of Rana chensinensis and BHT

由图3可知，林蛙卵黑色素和BHT对DPPH自由基的清除率随着浓度的升高而逐渐增大，其中，林蛙卵黑色素的IC50为0.404 mg/mL，阳性对照组BHT的IC50为0.445 mg/mL，这表明林蛙卵黑色素对DPPH自由基的清除能力略高于阳性对照组BHT的清除能力，林蛙卵黑色素具有较强的DPPH自由基清除能力。

2.6 超氧阴离子清除能力结果

林蛙卵黑色素和BHT清除超氧阴离子能力见图4。

图4 林蛙卵黑色素和BHT清除超氧阴离子能力Fig.4 Superoxide-radical scavenging of melanin from ovum of Rana chensinensis and BHT

由图4可知，在测试浓度范围内（0.1 mg/mL～4.0 mg/mL），林蛙卵黑色素和BHT对超氧阴离子的清除率随着浓度的提高而逐渐增大，其中，林蛙卵黑色素对超氧阴离子的半数清除率，即林蛙卵的IC50为1.250 mg/mL，阳性对照组BHT的IC50为0.646 mg/mL，这表明林蛙卵黑色素具有一定的超氧阴离子清除能力，但低于阳性对照BHT的超氧阴离子清除能力。

2.7 羟自由基清除能力结果

林蛙卵黑色素和BHT清除羟自由基能力见图5。

图5 林蛙卵黑色素和BHT清除羟自由基能力Fig.5 Hydroxyl radical of melanin from ovum of Rana chensinensis and BHT

由图5可知，林蛙卵黑色素和BHT在测试测试浓度范围内（0.1 mg/mL～4.0 mg/mL）对羟自由基的清除率随着浓度的增大而增大，其中林蛙卵黑色素的IC50为0.662 mg/mL，阳性对照组BHT的IC50为1.574 mg/mL，这表明林蛙卵黑色素对羟自由基的清除能力高于阳性对照组BHT的清除能力，林蛙卵黑色素具有较强的羟自由基清除能力。

3 结论

对林蛙卵黑色素进行紫外-可见光谱扫描、傅里叶红外光谱扫描、元素分析、溶解性试验以及体外抗氧化测定，结果显示，林蛙卵黑色素在可见光区无特征吸收峰而且较为平坦，在280 nm处有一肩峰，推测这个肩峰可能是与林蛙卵黑色素紧密结合的蛋白质的特征吸收峰；林蛙卵黑色素含有羟基、氨基、C=O、C=C、CH 及芳香基团，这与 Cheng 等[19]、Wang 等[20]和Selvakumar等[21]的结果十分相似；元素分析表明林蛙卵黑色素主要含有真黑色素；林蛙卵黑色素对DPPH自由基的IC50为0.404 mol/mL，对超氧阴离子的IC50为1.250 mg/mL，对羟自由基的IC50为0.662mg/mL。