微生物洁净室管理与检测质量控制规程的探讨*

黄启红熊 娟 蔡大川 张志军 黄璇莹 陈敏儿 伍玲燕

（中国广州分析测试中心，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州 510070）

洁净室在微生物检测过程中处于核心地位，直接决定检测结果的准确性。如果洁净室的洁净度不达标，或因为其他原因受到污染，微生物检测过程将得不到控制，最终的检测结果数据也是无效的。因此，微生物实验室在把控检测质量时必须严格按照洁净室管理维护操作规程的要求，做好洁净度监控。本文从微生物检测实际经验出发，对微生物洁净室的管理维护进行了阐述和讨论，希望为微生物检测的同行和相关从业人员提供参考依据。

1 职责

1.1 操作人员职责

操作人员进行微生物检测时，应按照相关标准方法及微生物实验室规程进行操作，并填写相关记录表。

1.2 管理人员职责

管理人员负责洁净室的日常运作和督促检查安全、卫生和监测。

1.3 质量监督人员职责

质量监督人员负责对员工进行定期监督。

2 操作程序

2.1 检验人员

a）检测人员应熟悉生物检测安全操作知识和消毒知识，并经培训上岗。

b）现场采样时，必须有2人参加，并对抽样设备进行严格消毒。采样时穿白大褂，佩戴手套和口罩做到无菌操作采样，并填写采样记录。

2.2 设施和环境条件

a）对需要在无菌条件下工作的区域（洁净室），应有明确标识。常规微生物项目在洁净操作台检验，致病菌在生物安全柜检测。

b）洁净室使用前必须打开洁净室的紫外灯辐照灭菌30min以上，操作人员进入洁净室前应先关掉紫外灯，并且同时打开通风过滤系统。操作完毕后，及时清理洁净室，并关闭通风过滤系统。

c）实验人员进入洁净室前，必须在缓冲间更换专用鞋，然后洗手消毒，更换工作服，戴好帽子、口罩等，做好各项防护措施，方可进入洁净室进行操作。非实验人员不准进入洁净室，确因工作需要或上级部门检查工作时，经室主任批准后，更换鞋、衣服后进入，并在《进入洁净室人员登记表》上登记。

d）工作人员在洁净室内工作时，动作要轻，严格执行无菌操作规程，尽量避免与工作无关的谈话，不做易发尘和大幅度的动作，防止微生物污染。

e）洁净室应保持清洁，严禁堆放杂物，以防污染。洁净室的地拖、抹布等清洁工具应标识清楚，与非洁净室的严格区分。洁净室应定期清洁消毒并做好监控记录。

2.3 实验工器具

a）需要带入洁净室使用的仪器、器械（如剪刀、镊子、药匙等）、玻璃器皿等所有物品，均应包扎严密，并应经过适宜的方法消毒灭菌。灭菌后的器具和器皿存放于洁净室内，并标识清楚。

b）未经消毒的器具存放于前处理室。

2.4 检测样品处理

a）检测样品按样品保存条件要求进行保存。需冷藏、冷冻的样品贮存在样品冰箱中，并做好检测状态标识。b）样品称量需在洁净室内进行，防止被污染。c）所有的检测样品及用具均应从经消毒的传递窗传递。

2.5 检测质量控制

a）吸取菌液时，必须用吸耳球吸取，切勿直接用口接触吸管。

b）如有菌液洒在桌上或地上，应立即用配制好的二氧化氯消毒液倾覆在被污染处至少30min，再做处理。

c）洁净室应每2个星期进行沉降菌测试。

d）检测人员应严格按作业指导书规范操作。

e）检测所用培养基必须从合格供应商处采购，并经验收合格后方可使用。

f）外部质量控制。按中心年度质量控制计划积极参加实验室能力验证和实验间比对活动，确保检测质量。

g）内部质量控制。在每次检测过程中，实验室应根据需要设置阳性对照、阴性对照和空白对照，定期对检验过程进行质量控制。

2.6 洁净室沉降菌的测试

2.6.1 测试前准备

测试前先打开洁净室的紫外灯辐照灭菌30min以上，然后关闭紫外灯，并且同时打开送排风系统和监控系统，在净化空气调节系统正常运行时间不少于10min后进入测试。

2.6.2 测试状态

静态测试，要求室内测试人员不得多于2人。

2.6.3 采样点数量及其布置

当洁净室面积≤30m2时，取样点定为从所设定的一条对角线上选取3点，即中心1点，两端各距墙1m处各1点。当洁净室面积≥30 m2时，选取东、南、西、北、中5点，其中东点、南点、西点、北点均距墙1m。生物安全柜采用5点采样法布点，采样点位置分布示意图同图1。

图1 工作区洁净度采样点位置分布示意图

2.6.4 培养基选用

测试菌落总数时选择大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA），测试霉菌或酵母菌时选用沙氏培养基（SDA）。

2.6.5 测试步骤

洁净室沉降菌测定步骤如下：将已制备好的培养皿按采样点布置图逐个放置，然后从里到外逐个打开培养皿盖，使培养皿表面暴露在空气中。按照静态测试法，培养皿暴露时间为30min。全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30℃～35℃培养48 h±2 h；采用沙氏培养基（SDA）的培养皿经采样后，在20℃～25℃培养5 d。每次取3个对照皿，与采样皿同法操作但不需暴露采样，然后与采样后的培养皿（TSA或SDA）一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。

生物安全柜沉降菌测试步骤如下：在每个取样点并列放置3个平皿，共放置15个平皿，暴露30 min。测试菌落总数时采样后将大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA） 平皿放入30℃～35℃的恒温培养箱中，并用2块空白平皿作为阴性对照，培养48 h±2 h，计数并判定结果。测试霉菌或酵母菌时,采用沙氏培养基（SDA）的培养皿经采样后，在20℃～25℃培养5 d。

2.6.6 沉降菌菌落计数

用肉眼对培养皿上所有的菌落直接计数、标记或在菌落计数器上计，然后用5～10倍放大镜检查是否有遗漏。若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数，沉降菌的数目以个/皿表示。

2.6.7 采样次数

每个采样点采样1次。

2.6.8 采样注意事项

a）单向流洁净室（区） 或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向；

b）布置采样点时，至少应尽量避开尘粒集中的回风口；

c）采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动；

d）应采取一切措施防止采样过程中的污染和其他可能对样品的污染。

2.6.9 记录

按要求填写洁净室监控记录。

2.6.10 结果计算

每个测定点的沉降菌平均菌落数的计算公式如下：

平均菌落数＝（1号培养皿菌落数+2号培养皿菌落数+……n号培养皿菌落数）÷n

2.6.11 结果评定

每个测定点的沉降菌平均菌落数必须低于所选定评定标准的界限，在静态测试时，若某个测定点的沉降菌平均菌落数超过评定标准，应对洁净室进行彻底消毒灭菌，然后重新采样2次，测试结果达到评定标准方能判为合格。评定标准见表1。

表1 评定标准

2.7 废物（液） 的处理

a）致病菌样品检测完后，需经传递窗传出到灭菌间，经高温高压灭菌后方能进行清洁处理。

b）废物（液）绝不允许倾倒于下水道中，应定期通知中心办公室将废物（液）交由有资质的单位进行处理，并对废物（液）的灭菌处理进行记录。

3 结论

微生物洁净室的管理和检测质量息息相关，洁净室的管理维护是一个持续的过程，应重视制度、人员等起到的作用，重视日常管理维护措施，保障洁净室的洁净度，才能确保检测质量。本研究探讨适用于洁净室的管理与检测质量控制，可为微生物洁净室管理和维护提供实用性的参考。