沉默miR-345表达联合氟尿嘧啶对胃癌细胞MGC803增殖的影响

马俊 李博 王丽萍 许鸣

胃癌是世界范围内难治性肿瘤之一，其发病率和病死率位居各恶性肿瘤前列[1-3]。化学治疗是胃癌的主要治疗方法，氟尿嘧啶作为胃癌化学治疗的一线药物，治疗剂量和中毒剂量较接近，使其应用受到一定的限制[4]。因此，探索如何提高化学治疗药物的疗效、减少其不良反应，成为近年研究的热点。笔者前期研究发现过度表达的微小RNA-345(miR-345)提示胃癌患者的术后生存期更短[5]。沉默miR-345表达可引起细胞周期进程的停滞而减慢细胞生长速度。本研究在前期研究基础上沉默胃癌细胞中miR-345的表达后，观察胃癌细胞在氟尿嘧啶作用下细胞生长速度、侵袭能力等变化情况，为增加胃癌化学治疗敏感性寻找到新的作用靶点，现报告如下。

材料与方法

一、材 料

胃癌MGC803细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；胎牛血清购自吉泰生物公司；Trizol购自 Invitrogen公司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；miR-345的 逆转录和实时定量PCR引物由Invitrigen公司设计、合成；实时定量PCR检测试剂盒购自Roche公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自Sigma公司。Transwell小室购自Corning公司。

二、方 法

1.细胞的培养

胃癌MGC803细胞在5%CO2、37 ℃饱和湿度条件，于10%胎牛血清(Hyclone)的改良型RPMI1640下培养，每2～3 d胰酶消化并传代1次。

2.反义miR-345寡核苷酸的设计合成及转染

从miR靶基因库(http://microrna. sanger. ac. uk/targets/v3)获得miR-345基因序列，设计并合成甲基化miR-345反义序列5’-UTCAATGTUG-AATCCAGCAUAAGCUAGAGUCC-3’，无义序列5’-UCUACUCUUAGGAGGUUGUUGATGCA-3’。将细胞接种于培养板，LipofectamineTM2000转染试剂转染，在5 min内同稀释的寡核苷酸序列混合，将复合物加入到细胞培养板中继续培养48 h。

3.miR-345表达水平的实时定量PCR检测

miR-345反向引物5’-TATGCTGCTCGGGACCTGATCCTCA-3’，正向引物5’-GTCGTATCCAGTGCA-GGGTCCGAGG-3’，内参U6反向引物5’-ACAGTA-GGAACGCGTCCCCGGTACG-3’，正向引物5’-GCA-GGGTCCGAGGTATTCGCACTGG-3’。反应体系：2份实时定量PCR混合液10 μl，正反向引物(4 μmol/L)各1 μl，双蒸水补足体积至20 μl。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，共40个循环。所得结果采用目的基因与内参基因CT值比较后的数值(△CT)。

4.细胞增殖能力的MTT 检测

收集对数生长期MGC803细胞，以5×103/孔接种细胞于培养板中，每孔100 μl，实验设3组：空白对照组(不转染)、无义序列组(转染miR-345无义序列)、as-miR-345 组(转染miR-345反义序列)，各组又设6个氟尿嘧啶浓度：0、10、20、40、80、160 μg/ml，每组均设3个复孔，加药处理48 h后，加入20 μl MTT 溶液，孵育4 h，加入150 μl 二甲亚砜震荡10 min，酶联免疫检测仪490 nm 波长处测吸光度；细胞生长抑制率(IR)=(对照组吸光度值-加药组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%，IR>70%、51%～70%、31%～50%、≤30%分别对应细胞对药物高度敏感、中度敏感、低度敏感、耐药。

5.Transwell-matrigel体外侵袭试验

Matrigel胶与无血清培养液按1∶3比例稀释，取50 μl铺于Transwell上室中，用无血清培养液重悬MGC803细胞并种入Transwell上室中(每室1×106/μl)，下室中加入完全培养基，于37 ℃培养箱中培养96 h后取出Transwell小室，用棉棒擦净聚碳酸滤膜上的Matrigel 胶，得到小室下面的聚碳酸滤膜，加入多聚甲醛500 μl 固定穿过滤膜的细胞，后风干、结晶紫染色15 min，荧光显微镜下随机取每孔周围和中间5个视野拍照，计数并取平均值。

三、统计学处理

结 果

一、荧光显微镜下转染miR-345反义序列后的MGC803细胞变化

荧光显微镜下，转染后的MGC803细胞带有绿色荧光，说明细胞转染成功(脂质体携带绿色荧光蛋白基因，其在荧光显微镜下可发出具有特征性的绿色荧光)，见图1。

图1 转染miR-345反义序列后的MGC803细胞(荧光显微镜，×100)

二、转染反义序列对MGC803细胞miR-345 mRNA表达水平的影响

3组的miR-345 mRNA表达水平比较差异有统计学意义(F=43.205，P< 0.001)。其中空白对照组与无义序列组中miR-345 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，as-miR-345 组细胞miR-345 mRNA表达水平低于无义序列组及空白对照组(P均< 0.01)，说明转染miR-345反义序列可下调MGC803细胞中miR-345 mRNA表达水平，见图2。

图2 转染反义序列对MGC803细胞miR-345 mRNA表达水平的影响

三、沉默miR-345表达联合氟尿嘧啶对MGC803细胞增殖能力的影响

空白对照组中，伴随氟尿嘧啶浓度增加，MGC803细胞IR亦有所增加；在0～80 μg/ml时，同一氟尿嘧啶浓度下as-miR-345组的细胞IR均高于空白对照组和无义序列组，表明氟尿嘧啶联合沉默miR-345表达的作用大于氟尿嘧啶的单独作用；as-miR-345组在40 μg/ml时已达高度敏感，而无义序列组和空白对照组对浓度<40 μg/ml的氟尿嘧啶耐药，说明沉默miR-345表达可增加MGC803对氟尿嘧啶的敏感性，见图3。因此选用氟尿嘧啶40 μg/ml进行Transwell-matrigel体外侵袭试验。

图3 沉默miR-345联合氟尿嘧啶对MGC803细胞增殖能力的影响

四、沉默miR-345联合氟尿嘧啶对MGC803侵袭能力的影响

as-miR-345 组、无义序列组+氟尿嘧啶组、空白对照组+氟尿嘧啶组的穿膜细胞数少于空白对照组(总体比较F=40.502、P<0.001，组间两两比较P均<0.05)，说明氟尿嘧啶或沉默miR-345表达均能抑制MGC803的侵袭能力；as-miR-345+氟尿嘧啶组穿膜细胞数少于as-miR-345组、空白对照+氟尿嘧啶组(总体比较F=35.832、P<0.001，组间两两比较P均<0.05)，说明沉默miR-345联合氟尿嘧啶对细胞的侵袭能力抑制效果更显著，见图4。

讨 论

氟尿嘧啶作为胃癌化学治疗的一线药物，其抗肿瘤机制主要是抗代谢，是细胞周期特异性抗恶性肿瘤药物[6-7]。氟尿嘧啶的抗瘤范围较广，但其不良反应也较多，治疗剂量和中毒剂量较接近，使其应用受到一定的限制。如何提高氟尿嘧啶化学治疗的效果、减少其不良反应，对于胃癌的治疗具有重要的意义。

笔者前期研究显示，miR-345的表达与胃癌的TNM分期密切相关。过度表达的miR-345预示患者的术后生存期更短[8]。据此推测，降低miR-345的表达可能是增加胃癌细胞对氟尿嘧啶化学敏感性的新策略。因此，本研究沉默miR-345表达后，观察胃癌细胞对氟尿嘧啶的药物敏感性变化，为将来进一步研究miR-345参与提高氟尿嘧啶对化学治疗敏感性研究提供基础。

图4 沉默miR-345联合氟尿嘧啶对MGC803侵袭能力的影响(苏木素-伊红染色,×100)

本研究将miR-345反义序列转染至MGC803胃癌细胞，下调胃癌细胞中miR-345表达。为探索沉默miR-345表达联合氟尿嘧啶对MGC803细胞生物学行为的作用，研究设置0、10、20、40、80、160 μg/ml的氟尿嘧啶浓度，结果显示10～160 μg/ml氟尿嘧啶联合miR-345沉默均可抑制MGC803细胞增殖，且有协同作用，当氟尿嘧啶浓度为40 μg/ml时协同作用最为明显，说明沉默miR-345表达能增加MGC803对氟尿嘧啶的化学治疗敏感性。随后的Transwell-matrigel体外侵袭试验结果进一步提示，沉默miR-345表达联合氟尿嘧啶比单独处理对MGC803的体外侵袭能力抑制更明显。本研究表明，沉默miR-345在MGC803细胞中的表达，在一定程度上加强了胃癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性，其机制可能是沉默miR-345的表达能够阻滞胃癌细胞从G1期向S期的进程，引起细胞周期进程的停滞而减慢细胞生长速度。日后课题组将观察沉默miR-345表达联合氟尿嘧啶对MGC803细胞凋亡周期、迁移能力等生物学行为的影响，为进一步探讨基因靶向沉默联合化学治疗药物治疗胃癌及化学治疗增敏提供实验依据。