达比加群酯磷脂复合物纳米乳的制备及体外评价

刘晓庆，郑春丽，张雅捷，何新怡，柴夫娟，陈 敏

(1.上海市浦东新区周浦医院药剂科，上海 201318；2.中国药科大学药学院，南京 210009)

达比加群酯(dabigatran etexilate，DE)是一种新型的直接凝血酶抑制剂，是达比加群的前药，主要用于预防非瓣膜性房颤患者的卒中和全身性栓塞[1-2]。DE水溶性差，渗透性良好，是生物药剂学分类系统BCS Ⅱ类药物[3-4]，由于生物利用度差，临床应用受限[5-6]。

纳米乳给药体系作为提高难溶性药物口服生物利用度的理想载体是目前研究的热点[7-10]，本研究将DE制成达比加群酯磷脂复合物(dabigatran etexilate phosphlipid complex，DE-PC)，并将其包封于纳米乳中制成DE-PC纳米乳，以期结合磷脂复合物和纳米乳的优点提高DE的口服生物利用度[11-14]。

1 仪器与试药

1.1仪器 UV-2102 PC 紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；ZETA SIZER 3000 H SA粒径仪(英国MALVERN公司)；JY 92-IIDN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；3K30冷冻离心机(德国Sigma公司)；DZF-6020台式真空干燥箱(镇江市科学仪器仪表有限公司)。

1.2试药 达比加群酯(上海谱振生物科技有限公司，含量99.8%，批号20130915)；卵磷脂(PC，德国Lipoid，上海东尚生物科技有限公司)；乙二醇单乙基醚,中链脂肪酸甘油酯(MCT，LabrafacTMLipophile WL1394)，法国GAITEFOSSE公司；聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor®RH40，德国BASF公司)；葡聚糖凝胶(G-50，上海金穗生物科技有限公司)；其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1DE-PC纳米乳的制备

2.1.1DE-PC的制备 精密称取处方量(DE-卵磷脂=1∶1.5，质量比)的DE和卵磷脂，置于圆底烧瓶中，加入适量二氯甲烷，使DE的质量浓度为25 mg·mL-1。水浴(30 ℃)反应3 h后，减压旋转蒸发除去二氯甲烷。将收集到的产物再用乙腈溶解，抽滤后收集滤液并减压旋蒸，真空干燥24 h，得DE-PC。

2.1.2三元相图的绘制 根据前期研究[15]，选择以1∶1质量比例混合的油酸和中链脂肪酸三酰甘油(MCT)为油相。以聚氧乙烯氢化蓖麻油为乳化剂，乙二醇单乙基醚为助乳化剂，乳化剂和助乳化剂的质量比Km为2∶1，得混合物(Smix)，与油相按照1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1的比例混匀，固定总质量为1 g，加入DE-PC 25 mg，室温搅拌下逐滴加入蒸馏水，以形成澄清透明或半透明的带淡蓝色乳光的溶液作为纳米乳形成的临界点，记录临界点时各组分的百分比。以Smix、油相和水分别作为3个顶点，3条边各为相应两组分的比例关系，绘制三元相图。

2.1.3制备工艺单因素考察 选择油酸-中链脂肪酸甘油酯(混合比为1∶1)为油相，聚氧乙烯氢化蓖麻油为乳化剂、乙二醇单乙基醚为助乳化剂，油相、乳化剂、助乳化剂和水的质量比为2∶2∶1∶15，加入处方量DE-PC于上述油相、乳化剂和助乳化剂的混合物中，超声溶解并混匀，磁力搅拌下逐滴加入恒温水相中进行乳化，得初乳，进一步探头超声得到纳米乳。以粒径和多分散系数为评价标准，对制备过程中的搅拌速度、搅拌时间、乳化温度以及探头超声时间进行单因素考察。

2.1.4制备工艺的正交优化 根据单因素考察结果，选择搅拌速度、乳化温度和探头超声时间3个因素进行正交实验[16-17]，各因素取3个水平，因素和水平见表1。以纳米乳的外观、离心稳定性和粒径作为评价指标，对各项指标进行评分，然后将各指标得分相加得总分，以3项总分作为综合评价标准。具体评分标准：①外观：澄清、透明、蓝色乳光明显、均一、稀薄为5分，一项不满足减1分；②离心稳定性：以12 000 r·min-1离心15 min，不分层无药物析出为5分；不分层但有极少药物析出为4分；不分层有少部分药物沉积为3分；不分层有较多药物沉积为2分；分层且大部分药物沉积为1分；③粒径：平均粒径在50 nm内为5分；在50～100 nm为4分;在100～150 nm为3分；150～200 nm为2分；200 nm以上为1分。

2.2DE-PC纳米乳理化性质

2.2.1粒径与电位 按照最佳处方工艺制备DE-PC纳米乳，用蒸馏水稀释100倍，以激光粒径仪测定粒径和Zeta电位，各样品测定3次。

表1正交设计因素与水平

Tab.1 Factors and levels of the orthogonal design

水平因素A,乳化温度/℃B,搅拌速度/r·min-1C,超声时间/s1251004823720096350300120

2.2.2包封率的测定 按照最佳处方工艺制备DE-PC纳米乳，将DE-PC纳米乳0.2 mL加于预先制备的葡聚糖凝胶微柱上端，将微柱置于10 mL离心管中,以2 500 r·min-1离心5 min，取出，继续加蒸馏水0.2 mL，再以2 500 r·min-1离心5 min，收集离心管中微柱洗脱下来的带乳光部分，用无水乙醇破乳后测DE的含量，计算包封率[18-19]。

包封率=收集得到的带乳光部分的药物含量÷纳米乳中药物的含量×100%

2.3DE-PC纳米乳的稳定性考察

2.3.1稳定性常数测定 取3份DE-PC纳米乳5 mL置于离心管中，以4 000 r·min-1离心15 min，刺破管底，收集1 mL，取收集液和离心前纳米乳各100 μL,置于10 mL量瓶中，用蒸馏水稀释定容，于500 nm处测定离心前后的吸光度值A0和A，按照下式计算稳定性常数Ke[20]。

四氢呋喃用量和提取温度对叶黄素提取量影响的响应面和等高线见图5。如图5所示，固定KOH甲醇溶液质量浓度为0.1g/mL，当提取温度一定时，稻谷中叶黄素提取量随四氢呋喃用量的增加而增加，到达峰值后，叶黄素提取量缓慢下降；当四氢呋喃用量不变时，提取量随温度的上升而增加，在温度到达50℃后，叶黄素提取量随温度上升而逐渐下降。

Ke=(A0-A)÷A0×100%

2.3.2离心稳定性考察 取3份DE-PC纳米乳5 mL，置于离心管中，分别以4 000，8 000和12 000 r·min-1离心30 min，观察是否有分层和药物析出。

2.3.3稀释稳定性考察 取DE-PC纳米乳适量，加入37 ℃的蒸馏水，分别将其稀释10，50，100，200和500倍，并用激光粒度仪测定粒径，考察稀释倍数对DE-PC纳米乳的粒径的影响。取DE-PC纳米乳适量，分别以pH值为1.2，2.0和3.0 的盐酸溶液及pH值为4.0和6.86的磷酸缓冲液、蒸馏水为稀释介质，将DE-PC纳米乳稀释100倍测定粒径，考察稀释介质对DE-PC纳米乳的粒径的影响。

2.3.4影响稳定性的因素考察 取适量DE-PC纳米乳，密封于西林瓶中，分别置于室温(25 ℃)、40 ℃和强光(4 500 lx)条件下。室温放置的DE-PC纳米乳分别于第30和90天取样，高温和强光下放置的DE-PC纳米乳分别于第5天和10天取样，测定粒径、DE含量和稳定常数，与第0 天时进行比较。其中，DE含量的测定采用UV法，于315 nm波长下测定。

3 结果

3.1DE-PC纳米乳的制备

3.1.1载DE-PC三元相图的绘制 在前期研究的基础上[15]，对筛选出的油相、乳化剂和助乳化剂系统进行载DE-PC的三元相图的绘制，结果见图1。由图1可知，与空白纳米乳体系相比，DE-PC纳米乳的三元相图的乳化区域面积有所增大，说明载药后的DE-PC纳米乳体系的稳定性良好。

图1载DE-PC纳米乳的三元相图

Fig.1 Ternary phase diagram of the nanoemulsion after drug loading

3.1.2DE-PC纳米乳制备工艺单因素考察

3.1.2.1磁力搅拌时间 搅拌时间对DE-PC纳米乳粒径和多分散系数的影响见图2。由图2可知，随着搅拌时间的延长，其粒径和多分散系数先变小后逐渐增大。可能的原因是搅拌力可分散纳米乳滴，但搅拌时间过长会增加纳米乳滴之间的碰撞，产生聚集现象，使粒径和多分散系数增大。故将搅拌时间定为10 min。

图2搅拌时间对DE-PC纳米乳粒径和多分散系数的影响

Fig.2 Effects of stirring time on particle size and PDI (n=3)

图3搅拌速度对DE-PC纳米乳粒径和多分散系数的影响

Fig.3 Effects of stirring speed on particle size and PDI (n=3)

3.1.2.3乳化温度 乳化温度对DE-PC纳米乳粒径和多分散系数的影响见图4。由图4可知，在一定范围内，随着乳化温度的增大，其粒径和多分散系数逐渐变小，在37 ℃下最小；继续升高温度，其粒径和多分散系数又逐渐增大。可见乳化温度对纳米乳粒径和多分散系数的影响较大，故需对乳化温度进行后续考察。

图4乳化温度对DE-PC纳米乳粒径和多分散系数的影响

Fig.4 Effects of stirring temperature on particle size and PDI (n=3)

3.1.2.4探头超声时间 探头超声时间对DE-PC 纳米乳粒径和多分散系数的影响见图5。由图5可知，随着探头超声时间增加，纳米乳的粒径和多分散系数先减小后增大，在96 s时最小。原因可能为，随着探头超声时间的增加，外界机械力在分散纳米乳滴的同时，增加了纳米乳滴之间的碰撞次数，产生乳滴聚集。可见探头超声时间对纳米乳粒径和多分散系数的影响较大，故需对探头超声时间进行后续考察。

3.1.3DE-PC纳米乳制备工艺的正交优化 DE-PC纳米乳制备工艺的正交实验设计结果见表2。由表2可知，3个因素对纳米乳粒径和稳定性的影响顺序为：乳化温度>超声时间>搅拌速度。由方差分析结果可知，乳化温度对粒径和稳定性有显著影响。最佳制备工艺为A2B2C2。具体制备步骤：取处方量的油酸、聚氧乙烯氢化蓖麻油和乙二醇单乙基醚，置于西林瓶中，磁力搅拌均匀后，加入处方量的DE-PC复合物，超声溶解后，磁力搅拌均匀，在200 r·min-1磁力搅拌下逐滴加入37 ℃的水相中，搅拌10 min后再用探头超声96 s，即得。

图5探头超声时间对DE-PC纳米乳粒径和多分散系数的影响

Fig.5 Effects of ultrasonic time on particle size and PDI (n=3)

表2正交实验结果

Tab.2 Results of the orthogonal design

编号ABC外观稳定性粒径得分111133392122444123133342942124551452234431162313328731312258321231693322226K110.009.337.67K211.009.6710.68K35.677.678.33R5.332.003.00PP<0.050.05

3.2DE-PC纳米乳的理化性质表征

3.2.1DE-PC纳米乳粒径与电位 粒径测定结果显示，DE-PC纳米乳的平均粒径为79.4±1.1 nm，多分散系数为0.172±0.009，说明纳米乳的粒径较小，且粒度分布较均匀。电位测定结果表明，DE-PC纳米乳的电位为-(22.1±0.8) mV，表明纳米乳体系稳定，不易发生粒子聚集现象。

3.2.2DE-PC纳米乳包封率 结果显示，DE-PC纳米乳对DE的包封率达到93.7%±1.2%。因此，在DE-PC纳米乳中，绝大部分药物被包封在内部油相，这对提高纳米乳中药物的稳定性和促进药物的吸收有着重要的作用。

3.3DE-PC纳米乳的稳定性

3.3.1稳定常数测定 结果表明，DE-PC纳米乳的稳定常数Ke为15.42%±1.10%，表明其稳定性较好。

3.3.2离心稳定性 DE-PC纳米乳在分别以4 000，8 000和12 000 r·min-1离心30 min后均无分层和药物析出现象，说明DE-PC纳米乳体系稳定性良好。

3.3.3稀释稳定性 不同倍数蒸馏水稀释对DE-PC纳米乳的粒径的影响见图6。由图6可知，其对DE-PC纳米乳的粒径和多分散系数影响均不明显。不同稀释介质对DE-PC纳米乳的粒径的影响见图7。由图7可知，其对DE-PC纳米乳的粒径和多分散系数的影响亦不显著，说明DE-PC纳米乳稀释稳定性良好。

图6稀释倍数对DE-PC纳米乳粒径的影响

Fig.6 Effects of dilution multiple on particle size and PDI (n=3)

图7稀释介质对DE-PC纳米乳粒径的影响

Fig.7 Effects of dilution media on particle size and PDI (n=3)

3.3.4影响稳定性的因素 见表3。由表3可知，DE-PC纳米乳在室温25 ℃保存时，其外观、粒径、稳定性常数和药物含量在90 d内基本保持不变，说明DE-PC纳米乳在室温条件下可以较长时间保持稳定。然而，在40 ℃和强光条件下，DE-PC纳米乳均在第10天出现了粒径增大、稳定性常数变大和DE含量下降，稳定性减弱。因此，为尽量避免DE的析出和降解，DE-PC纳米乳应在室温避光条件下储存。

表3影响DE-PC纳米乳稳定性的因素

Tab.3 The fators of stability of DE-PC nanoemulsion(n=3)

影响因素时间/d粒径/nmKe/%含量/%40 ℃079.5±0.216.92±1.0199.56±0.15582.9±0.521.05±2.1498.91±1.001089.4±0.734.70±2.2296.51±1.234 500 lx584.1±0.424.51±2.3098.12±0.841092.3±0.735.10±2.4695.78±0.9125 ℃3080.1±1.017.57±1.6399.61±0.079082.0±0.319.60±1.7898.50±0.50

4 讨论

通过单因素考察和正交实验设计优化了DE-PC纳米乳的制备工艺，DE-PC纳米乳的粒径和稳定性受乳化温度影响较为显著。优化后的制备工艺为乳化温度37 ℃，搅拌速度200 r·min-1，探头超声96 s；所得DE-PC纳米乳的粒径在100 nm以内，且粒度分布均匀，包封率高，稀释稳定性和离心稳定性均良好。室温放置3个月的实验结果表明，制备DE-PC纳米乳的粒径、稳定常数和药物含量均未发生显著变化，因而制剂的储存稳定性良好。

本研究将低水溶性、高渗透性药物DE成功制成粒径均一、稳定的DE-PC纳米乳，以期利用磷脂复合物和纳米乳的双重优点提高DE的口服生物利用度，为提高同类药物生物利用度的研究提供参考。在后续研究中，将对DE-PC纳米乳的动物体内吸收和生物利用度作进一步研究。