肠激安制剂对大鼠的长期毒性实验研究

廖小红，唐洪梅，丘振文，何嘉仑，李得堂

(广州中医药大学第一附属医院，广州 510405)

肠激安制剂是在我院使用多年的临床经验方基础上开发的治疗腹泻型肠易激综合征的医院制剂[1-2]。处方由白芍、枳壳、石榴皮、延胡索、黄连和陈皮等组成，具有疏肝健脾、清热利湿和止痛止泻的功效，主治腹泻型肠易激综合征、腹痛腹泻和肠功能紊乱等，疗效确切，但该制剂的质量标准研究未见报道[3]。腹泻型肠易激综合征是一种常见的慢性非器质性肠功能紊乱性疾病[4-6]，临床症状表现为反复发作的腹痛腹泻，病程长[7]，严重影响患者的生活质量。肠激安制剂从肝脾论治，治疗肝郁脾虚型腹泻型肠易激综合征效果明显，机制研究表明，其能通过调节脑-肠轴异常改善腹泻型肠易激综合征大鼠的症状，但目前尚无肠激安制剂的长期毒性研究报道，因此，为了进一步研究肠激安制剂长期用药的安全性，为肠激安制剂的临床安全用药及新药开发提供实验依据，根据《中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则》[8]，本文进行了肠激安制剂对大鼠的长期毒性研究。

1 仪器与材料

1.1仪器 950FS全自动动物血液分析仪(美国HEMAVET公司)；日立7020型全自动生化分析仪(日本日立公司)；H-300尿液分析仪(长春迪瑞医疗科技股份有限公司)。

1.2试药 肠激安制剂(批号100403，广东省中医研究所工艺研究室)；钙、磷、总胆红素、谷丙转苷酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、三酰甘油和总胆固醇测试盒(批号：20081116，20090511，20090711，20090614，20090615，20090713，20090616，20090714，购自北京利德曼公司)；葡萄糖测试盒(批号20090510，中生北控生物科技股份有限公司)；肌酐、尿素氮测试盒(批号：20090406，20090614，烟台奥斯邦生物工程有限公司)；总蛋白、白蛋白和球蛋白测试盒(批号：20090410，20090515，20090509，上海科华东菱诊断用品有限公司)。

1.3实验动物 SPF级SD大鼠，80只，6～7周龄，雌雄各半(实验设施许可证号：SCXK(粤)2008-0002，实验动物合格证号：N00070059)，由广东省医学实验动物中心提供。

2 方法

2.1分组与给药途径 6～7周龄SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，按照体质量随机分为对照组和肠激安制剂高、中、低剂量组，实验采用灌胃给药，给药途径与临床用药一致，各给药组按照剂量灌胃给药，给药体积为20 mL·kg-1，对照组同法灌胃给予蒸馏水20 mL·kg-1。

2.2剂量设置 肠激安制剂临床拟用量为每日0.264 g，本实验根据肠激安制剂的特点，设置高、中、低剂量，分别为15.624，7.812和3.906 g·kg-1，相当于拟用临床剂量的60，30和15倍。

2.3给药方法及检测指标 每日上午9时灌胃给予药物，20 mL·kg-1·d-1。每日1次，连续给药6周，每周测定1次体质量，并根据体质量调整给药量，恢复观察期为停药后2周。每周测量其体质量和进食量，于给药6周后、停药2周后每组随机处死10只大鼠，雌雄各半，动物处死前禁食12 h，收集尿液、全血、血清和主要脏器进行尿常规、血常规、血生化和病理组织学检查。尿常规：测定尿液中葡萄糖、胆红素、酮体、尿比重、酸碱度、尿蛋白、尿胆原、亚硝酸盐、潜血和白细胞等；血常规：测定大鼠红细胞、全血白细胞、嗜中性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱细胞数量以及嗜中性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱细胞比率；血生化：检测大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、白球比、总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶、葡萄糖、尿素和肌酐；对动物进行尸检，取动物重要脏器：心、肝、脾、肺等称定质量，计算脏器系数，进行病理组织学检查。数据处理由SPSS 15.0统计软件完成。

3 结果

3.1一般状态观察 整个实验过程中以及停药恢复期2周内，各组大鼠动物采食、毛色、活动、大鼠呼吸、口、眼、鼻、耳、大小便形状和颜色等均正常，大鼠无死亡。

3.2对大鼠体质量的影响 见表1。由表1可知，在给药前、给药期间以及停药恢复观察期内，肠激安制剂高、中、低剂量组大鼠体质量、进食量与对照组大鼠相比基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1肠激安制剂对大鼠体质量的影响

测定时间/周性别对照组/g肠激安方高剂量组/g肠激安方中剂量组/g肠激安方低剂量组/g 0雄性93.76±5.4693.69±6.69*94.06±6.86* 93.68±8.55*雌性88.21±6.4288.33±6.04#88.27±6.64# 88.29±2.97#1雄性155.21±12.09154.86±10.43*155.25±11.10*150.43±14.71*雌性141.75±9.08142.22±10.84#142.02±8.73#136.57±5.50#2雄性178.50±15.24174.63±10.53*191.24±10.92*179.93±15.56*雌性159.76±12.65163.60±22.23#165.62±17.26#164.09±9.88#3雄性247.52±18.77256.66±13.80*264.38±22.92*269.62±23.31*雌性201.51±10.70206.65±14.99#201.07±16.66#202.04±6.71#4雄性300.51±18.97297.20±14.40*306.73±12.65*312.72±29.12*雌性215.51±15.64224.62±18.95#219.81±23.55#218.14±10.48#5雄性352.83±25.72339.70±18.09*357.58±14.36*357.26±31.78*雌性233.32±19.41233.55±20.64#237.35±26.89#233.68±10.73#6雄性381.03±33.30371.32±19.31*395.92±20.67*394.86±33.64*雌性246.51±21.02248.49±22.23#257.37±28.78#246.86±12.30#7雄性396.10±33.20387.24±20.98*403.45±46.51*408.63±34.72*雌性259.25±23.14258.68±22.04#261.46±31.15#252.65±13.31#8雄性426.46±26.71401.14±39.58*426.80±25.35*418.00±35.24*雌性252.18±18.78269.64±35.38#262.16±26.98#253.58±10.61#9雄性459.96±31.42434.44±41.89*460.06±30.31*448.56±38.78*雌性268.50±14.43287.78±27.56#271.34±21.33#266.36±7.60#

注：雄性大鼠与对照组比较*P>0.05；雌性大鼠与对照组比较#P>0.05。

3.3对大鼠尿常规指标的影响 见表2。由表2可知，与对照组比较，肠激安制剂高、中、低剂量组大鼠在给药6周后、停药恢复观察2周后尿液中葡萄糖、胆红素、酮体、尿比重、酸碱度、尿蛋白、尿胆原、亚硝酸盐、潜血和白细胞等各项检测指标含量差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2肠激安制剂对大鼠尿常规指标的影响

测定项目测定时间对照组肠激安方高剂量组肠激安方中剂量组肠激安方低剂量组尿比重 给药6周停药2周1.008±0.0031.011±0.0041.007±0.003*1.009±0.003#1.007±0.003*1.011±0.004#1.007±0.002*1.010±0.004#酸碱度 给药6周停药2周6.900±0.2116.950±0.3696.700±0.258*6.800±0.587#6.850±0.242*6.800±0.350#6.850±0.242*6.800±0.350#尿亚硝酸盐 给药6周停药2周0.200±0.4221.000±0.0000.200±0.422*1.000±0.000#0.200±0.422*1.000±0.000#0.400±0.516*1.000±0.000#葡萄糖/mmol·L-1 给药6周停药2周0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#尿胆红素/μmol·L-1 给药6周停药2周0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#尿酮体/mmol·L-1 给药6周停药2周0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#尿蛋白/g·L-1 给药6周停药2周0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#尿胆原/μmol·L-1 给药6周停药2周0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#0.000±0.000*0.000±0.000#

注：给药6周后与对照组比较*P>0.05；停药2周后与对照组比较#P>0.05。

3.4对大鼠血常规指标的影响 见表3。由表3可知，给药6周后及停药恢复2周后肠激安制剂高、中、低剂量组大鼠血液中各项检测指标数值与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3肠激安制剂对大鼠血常规指标的影响

测定指标测定时间对照组肠激安方高剂量组肠激安方中剂量组肠激安方低剂量组白细胞(×109·L-1) 给药6周停药2周10.86±0.2811.10±0.7410.74±0.22*11.37±0.54#10.79±0.33*11.15±0.54#11.05±0.34*11.03±0.25#中性粒细胞(×109·L-1)给药6周停药2周 3.81±0.16 3.87±0.50 3.55±0.16* 3.95±0.40# 3.66±0.18* 3.97±0.15# 3.81±0.19* 3.73±0.18#淋巴细胞(×109·L-1)给药6周停药2周 5.11±0.30 5.08±0.23 5.05±0.13* 4.98±0.39# 4.90±0.21* 4.98±0.36# 4.84±0.23* 5.04±0.22#嗜酸性粒细胞(×109·L-1)给药6周停药2周 1.02±0.11 1.05±0.21 1.02±0.11* 1.07±0.19# 1.03±0.12* 1.09±0.14# 1.10±0.14* 1.06±0.14#嗜碱性粒细胞(×109·L-1)给药6周停药2周 0.53±0.07 0.56±0.16 0.54±0.06* 0.64±0.19# 0.58±0.09* 0.60±0.09# 0.59±0.11* 0.57±0.10#中性粒细胞百分比%给药6周停药2周33.21±0.9833.89±1.8933.04±0.89*34.63±2.11#33.85±0.95*34.32±1.26#33.45±1.74*33.82±0.96#淋巴细胞百分比/%给药6周停药2周47.03±2.4745.98±3.7947.11±1.78*43.99±4.92#45.42±2.15*48.30±11.08#44.96±2.63*45.70±2.60#单核细胞百分比/%给药6周停药2周 6.00±0.31 5.73±0.34 5.70±0.29* 5.72±0.35# 5.72±0.33* 5.78±0.27# 5.82±0.24* 5.78±0.26#嗜酸性粒细胞百分比/%给药6周停药2周 9.12±0.87 9.40±1.24 9.18±0.62*10.07±1.67# 9.70±0.79* 9.83±1.05# 9.43±0.95* 9.54±1.10#

注：给药6周后与对照组比较*P>0.05；停药2周后与对照组比较#P>0.05。

3.5对大鼠血液生化指标的影响 见表4。由表4可知，与对照组比较，给药6周后及停药恢复2周后肠激安制剂高、中、低剂量组大鼠血清中各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。

表4肠激安制剂对大鼠血生化指标的影响

项目测定时间对照组肠激安制剂高剂量组肠激安制剂中剂量组肠激安制剂低剂量组丙氨酸氨基转移酶/U·L-1给药6周28.60±3.5028.50±8.29*30.70±4.14*28.10±3.78*停药2周29.20±5.5729.10±6.42#28.90±6.84#30.30±5.14#天门冬氨酸氨基转移酶/U·L-1给药6周138.20±30.06137.90±39.18*133.10±11.36*128.30±9.67*停药2周123.30±19.32115.10±11.69#131.40±23.70#130.00±22.39#总蛋白/g·L-1给药6周71.79±3.0174.47±4.82*73.30±2.16*71.76±2.79*停药2周73.43±5.0273.14±4.69#75.75±4.45#75.24±4.90#白蛋白/g·L-1给药6周36.09±1.8437.09±2.45*37.17±2.21*36.51±1.60*停药2周36.47±2.4336.44±3.03#37.54±2.49#37.67±2.83#球蛋白/g·L-1给药6周35.70±2.3237.38±3.28*36.13±2.23*35.25±1.64*停药2周36.96±2.8536.70±2.70#38.22±2.79#37.57±2.23#阴离子间隙给药6周1.01±0.081.00±0.09*1.03±0.11*1.04±0.05*停药2周0.99±0.051.00±0.09#0.99±0.07#1.00±0.04#总胆红素/μmol·L-1给药6周0.68±0.260.62±0.27*0.68±0.26*0.83±0.22*停药2周0.98±0.181.02±0.33#0.99±0.21#0.97±0.32#直接胆红素/μmol·L-1给药6周0.36±0.160.34±0.15*0.31±0.11*0.36±0.12*停药2周0.44±0.080.51±0.19#0.46±0.13#0.45±0.16#碱性磷酸酶/U·L-1给药6周184.30±36.94188.50±56.72*161.10±37.10*186.00±46.47*停药2周155.50±50.93152.80±60.64#163.60±39.06#154.90±49.57#葡萄糖/mmol·L-1给药6周5.23±0.456.17±1.45*5.30±0.43*5.44±0.85*停药2周5.65±0.546.19±0.44#5.67±0.71#6.17±0.64#尿素/mmol·L-1给药6周5.96±0.705.42±0.79*5.79±0.33*6.12±0.95*停药2周6.01±0.655.80±0.53#6.00±0.68#6.21±1.03#肌酐/μmol·L-1给药6周59.28±16.3948.69±16.28*50.30±10.32*53.41±14.86*停药2周54.77±7.3552.49±10.70#50.65±8.14#47.89±14.03#钙/mmol·L-1给药6周2.60±0.112.71±0.12*2.78±0.36*2.61±0.10*停药2周2.80±0.262.76±0.16#2.84±0.30#2.75±0.15#磷/mmol·L-1给药6周2.58±0.272.62±0.44*2.70±0.37*2.70±0.56*停药2周2.43±0.402.40±0.40#2.46±0.37#2.46±0.37#镁/mmol·L-1给药6周0.99±0.041.03±0.11*1.03±0.07*1.03±0.11*停药2周1.04±0.051.00±0.06#1.08±0.11#1.07±0.09#总胆固醇/mmol·L-1给药6周1.98±0.282.04±0.41*1.88±0.31*1.87±0.24*停药2周2.09±0.261.93±0.20#1.94±0.27#2.05±0.24#甘油三酯/mmol·L-1给药6周1.07±0.290.87±0.28*1.00±0.39*1.01±0.45*停药2周1.26±0.501.22±0.46#0.98±0.29#1.09±0.29#

注：给药6周后与对照组比较*P>0.05；停药2周后与对照组比较#P>0.05。

3.6对大鼠脏器指数的影响 见表5。由表5可知，与对照组比较，肠激安制剂给药6周后和停药2周后肠激安制剂高、中、低剂量组大鼠主要脏器指数如心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脑、胸腺、睾丸(雄)、附睾(雄)、卵巢(雌)、子宫(雌)、甲状腺和前列腺(雄)指数等与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表5肠激安制剂对大鼠脏器指数的影响

项目测定时间对照组肠激安制剂高剂量组肠激安制剂中剂量组肠激安制剂低剂量组心给药6周0.267±0.0130.271±0.024*0.279±0.043*0.284±0.026*停药2周0.293±0.0250.309±0.052#0.289±0.027#0.305±0.029#肝给药6周2.660±0.1902.550±0.167*2.474±0.121*2.533±0.131*停药2周2.642±0.2262.533±0.167#2.520±0.187#2.625±0.242#脾给药6周0.206±0.0240.195±0.033*0.193±0.021*0.197±0.021*停药2周0.178±0.0310.198±0.022#0.183±0.036#0.183±0.031#肺给药6周0.534±0.1410.501±0.106*0.522±0.138*0.544±0.148*停药2周0.452±0.0580.448±0.052#0.471±0.077#0.466±0.080#肾给药6周0.641±0.0610.647±0.037*0.627±0.039*0.631±0.032*停药2周0.606±0.0340.627±0.034#0.599±0.044#0.673±0.190#脑给药6周0.586±0.0970.556±0.105*0.571±0.118*0.580±0.130*停药2周0.522±0.1730.546±0.117#0.533±0.149#0.541±0.130#肾上腺给药6周0.018±0.0050.019±0.005*0.022±0.005*0.023±0.008*停药2周0.025±0.0090.020±0.006#0.021±0.007#0.019±0.007#胸腺给药6周0.156±0.0470.139±0.040*0.147±0.044*0.141±0.038*停药2周0.128±0.0360.139±0.064#0.100±0.025#0.105±0.021#睾丸(雄)给药6周0.865±0.2360.862±0.063*0.888±0.085*0.814±0.066*停药2周0.792±0.0550.797±0.096#0.761±0.042#0.750±0.079#附睾(雄)给药6周0.307±0.0440.301±0.042*0.307±0.047*0.283±0.031*停药2周0.331±0.0840.349±0.056#0.297±0.058#0.294±0.030#卵巢(雌)给药6周0.053±0.0090.056±0.012*0.051±0.011*0.058±0.013*停药2周0.068±0.0170.054±0.013#0.062±0.024#0.054±0.005#子宫(雌)给药6周0.290±0.0840.273±0.081*0.249±0.093*0.240±0.066*停药2周0.253±0.1070.239±0.077#0.244±0.070#0.322±0.172#甲状腺给药6周0.011±0.0030.012±0.004*0.010±0.004*0.011±0.002*停药2周0.009±0.0020.010±0.003#0.008±0.002#0.008±0.003#前列腺(雄)给药6周0.143±0.0320.142±0.019*0.147±0.021*0.156±0.026*停药2周0.151±0.0420.146±0.030#0.107±0.043#0.127±0.013#

注：给药6周后与对照组比较*P>0.05；停药2周后与对照组比较#P>0.05。

3.7病理学检查 给药6周后和停药恢复2周后肠激安制剂高、中、低剂量组大鼠(n=10)组织病理学检查镜下观察心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺和胸腺等主要脏器与对照组基本相同，未见明显异常病理改变。见图1。

图1病理学检查结果

A.给药后6周;B.停药后2周;a.对照组；b.肠激安制剂高剂量组；c.肠激安制剂中剂量组；d.肠激安制剂低剂量组。

Fig.1 Results of pathological examination

A.6 weeks after administration；B.2 weeks after stopping use of the medicine；a.control group；b.high dose group of Changji′an Preparation；c.middle dose group of Changji′an Preparation；d.low dose group of Changji′an Preparation.

4 讨论

肠激安制剂是在我院使用多年的临床经验方基础上开发的治疗腹泻型肠易激综合征的医院制剂，本课题组对其工艺、质量标准、动物模型、药效学、毒理学及干预腹泻型肠易激综合征的机制等都有了成熟的研究[9-14]。肠激安制剂由白芍、柴胡、甘草、延胡索、黄连和陈皮等组成，有文献报道，白芍总苷在治疗干燥综合征27例中有1例出现严重腹泻，4例出现轻度腹泻[15]；黄连及其制品黄连素等有时会发生药物不良反应如药疹、变态反应以及血细胞减少等[16]；孙蓉等[17]发现，不同基源、炮制和提取方法的柴胡样品中柴胡总皂苷、柴胡皂苷a含量与急性毒性大小呈正相关，柴胡总皂苷小鼠口服 LD50为4.5 g·kg-1，大鼠给予柴胡30 d可致肝功能异常[18]。孙蓉等[19]研究证实,长时间、大剂量使用柴胡水煎剂可造成大鼠明显的肝毒性损伤，与临床报道一致。中药不是完全无毒的，其具有一定的偏性，因此对肠激安制剂的长期毒性研究具有重大意义。

研究结果表明，大鼠灌胃给予肠激安制剂高剂量15.624 g·kg-1·d-1(临床成人拟用剂量60倍)、肠激安制剂中剂量7.812 g·kg-1·d-1(临床成人拟用剂量30倍)和肠激安制剂低剂量3.906 g·kg-1·d-1(临床成人拟用剂量15倍)，每日1次，连续给药6周后与对照组比较，各项检测指标如一般状态、体质量、尿液、血液学、血液生化学、脏器系数和组织病理学等，未见明显的毒性敏感指标和毒性靶器官；停药恢复2周后肠激安制剂高、中、低剂量组大鼠各项检测指标均正常，未见肠激安制剂产生迟发性毒性反应和蓄积性毒性反应。实验结果表明，长期应用肠激安制剂对大鼠无明显毒性和不良反应，临床成人拟用剂量和疗程均处于安全范围。

综上所述，肠激安制剂高剂量(15.624 g·kg-1)为临床人用剂量60倍时，大鼠长期灌喂给药，未见明显毒性反应，表明肠激安方毒性小，按照临床拟用剂量服用是安全的。