复视明胶囊对糖尿病视网膜病变的药效研究

何萌杉，杨 倩，谢艳华，许 璐，张作明，张明科，王四旺

(1.空军军医大学药学院天然药物学教研室，西安 710032；2.空军军医大学航空航天临床医学教研室，西安 710032；3.西安乐健生物科技有限公司，西安 710032)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的并发症之一，是首要致盲因素之一，是临床上常见的视网膜微循环障碍性疾病[1-3]。临床常见的视网膜微循环障碍性疾病多属糖代谢紊乱等多因素共同作用的结果，其中氧化应激和炎症反应等条件下产生的视网膜细胞因子改变、细胞凋亡和微血管损伤是导致血管性疾病甚至全身微血管病变的重要因素[4]。DR在临床上尚无早期的预防措施，故研究安全有效的治疗药物对于防治DR具有重要意义[5]。

复视明胶囊由西洋参、黄芪、熟地、决明子、红花、珍珠和水蛭等12味中药组成，2004年作为军队医疗机构院内制剂[兰联制字(2004)FP68095号]用于临床，证实该方具有益气活血、滋阴补肾和通络明目的功能，适用于气虚血瘀、肝肾不足和脉络阻滞所致的DR。本研究旨在探讨复视明胶囊对链脲佐菌素(STZ)诱发的DR的防治作用及其机制，为其临床应用提供实验和理论支持。

1 仪器与材料

1.1仪器 AE-100电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；血糖仪(罗氏公司，卓越型)；高速低温离心机(美国贝克曼库尔特公司)；RT-9600半自动生化仪(雷杜生命科学有限公司)；YZ5S裂隙灯显微镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)；同步共焦激光眼底造影仪(德国海德堡公司)。

1.2试药 复视明胶囊(第四军医大学药物研究所，批号20151020)；羟苯磺酸钙胶囊(北京京丰制药集团有限公司，批号151117)；链脲佐菌素(STZ，美国西格玛公司，批号 WXBB2432V)；荧光素钠注射液(广州白云山明兴制药有限公司)；NOS试剂盒、T-SOD试剂盒(长春汇力生物科技有限公司)。

1.3动物 SD大鼠，SPF级，雄性，体质量200.0±20.0 g，周龄7～8 周，购自空军军医大学实验动物中心，许可证号：scxk(军)字第2012-007号。

2 方法

2.1试药配制 STZ 溶液：临用前将1 g STZ溶于100 mL pH值为4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，配制成质量浓度为10 mg·mL-1溶液；复视明灌胃液：临用前取胶囊内容物，用生理盐水配制成质量浓度为0.25 g·mL-1的混悬液；羟苯磺酸钙灌胃液：临用前取胶囊内容物，用生理盐水配制成质量浓度为0.05 g·mL-1的混悬液。

2.2DR模型 SD大鼠100只，雄性，随机分为空白对照组12只，造模组88只。造模组禁食12 h后，用剂量为60 mg·kg-1的STZ腹腔注射(ip.)[6-7]；空白对照组给予等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后用取血针从尾静脉取血测随机血糖，以血糖≥16.7 mmol·L-1，尿量及饮水量均明显增多者[8]视为成模，维持8周后，行视网膜电图(electroretinogram,ERG)和眼底血管荧光造影眼底荧光血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)项目检查。若造模大鼠出现视网膜电生理功能改变，眼底血管荧光造影背景荧光增强或显影困难，与空白对照组比较差异有统计学意义，则说明早期DR造模成功。糖尿病造模成功率为66%，再剔除给药前眼部检查项目中意外麻醉致死的大鼠数量，选取造模成功的50只大鼠进行实验。并随机选取周龄匹配的10只正常大鼠作为空白对照组。

2.3分组与给药方法 大鼠腹腔注射STZ 8周早期DR造模成功后分组并灌胃给药，即空白对照组灌胃4 mL·kg-1生理盐水(N)、模型组4 mL·kg-1生理盐水(DM)、阳性对照组0.2 g·kg-1羟苯磺酸钙胶囊(C)、复视明胶囊高剂量组1 g·kg-1(T1)、复视明胶囊中剂量组0.5 g·kg-1(T2)和复视明胶囊低剂量组0.25 g·kg-1(T3)，每日1次，每组10只。

3 观察指标及检测方法

3.1观察大鼠一般体征 观察大鼠精神活动状态、皮毛色泽、饮食量和二便等状况，每日给药前称定体质量并记录。

3.2血生化指标检测 腹腔注射STZ后第4，8和12周，采用剪尾的方法从大鼠尾部取血，用血糖仪测定血糖。于第12周，即给药4周后，用水合氯醛麻醉大鼠，从眼底静脉丛取血6 mL，置于10 mL离心管中，离心取上清液测定血总超氧化物歧化酶(T-SOD)和一氧化氮合酶(NOS)，所有测定方法均按照试剂盒说明书进行。

3.3视网膜ERG检查 给药前后即腹腔注射STZ后第8和12周行大鼠右眼ERG检查。在暗室环境下，取暗适应3 h的大鼠，采用10 g·L-1戊巴比妥钠(3 mL·kg-1)联合50%速眠新(每只大鼠0.05 mL)，腹腔注射，进行麻醉，固定，右眼滴复方托吡卡胺眼液散瞳并移至距刺激器背景光源30 cm处，连接各电极后记录ERG暗适应杆细胞反应b波、暗适应最大混合反应a波和b波、暗适应振荡电位(oscillatory potentials，OPs)OS2波、明适应视锥细胞反应b波和明适应30 Hz闪烁反应的幅值[9-12]。

3.4双眼FFA检查 给药前后即腹腔注射STZ后第8和12周行大鼠双眼FFA检查。大鼠麻醉采用复方托吡卡胺眼液散瞳，腹腔注射10%荧光素钠(2 mg·kg-1)后，在同步共焦激光眼底荧光造影仪下检测眼底组织结构并拍照[11,13-14]。

3.5白内障检查 按照3.4项下方法散瞳，大鼠双眼睑在裂隙灯显微镜下以弥散光照明法检查并选择最佳清晰图像拍照[9]，计数白内障眼数并计算白内障发生率(%)。

4 实验结果

4.1一般体征观察结果 对照组大鼠饮食、饮水量、活动、精神状态和二便均正常，被毛柔顺，毛色光泽，角膜透明无浑浊，屈光质清晰无异常。模型组大鼠可见典型“三多一少”症状，即多食、多饮、多尿和体质量减轻，呈现持续高血糖、被毛粗糙、毛色晦暗、枯黄、竖毛弓背、大便不成形、活动减少、嗜睡和精神萎靡等现象；复视明胶囊和阳性药治疗各组大鼠的上述症状明显改善。

4.2大鼠体质量的变化 空白对照组大鼠体质量随周龄增加而明显增加；模型组大鼠体质量基本维持在给药时水平；阳性对照组和复视明胶囊高、中、低剂量组大鼠体质量均呈增加趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1给药前后及期间不同时间大鼠体质量的变化

分组n8周9周10周11周12周空白组10448.20±54.71501.10±40.79531.00±33.07543.22±38.27560.78±40.80模型组10(1#)344.44±43.56a352.63±46.53a345.38±48.46a354.00±55.82a348.85±56.08a阳性对照组10(1#)334.00±61.55a344.88±63.43a341.75±62.99a360.14±46.37a352.00±63.90a复视明胶囊高剂量组10322.10±46.74a335.00±60.35a325.20±59.55a338.40±69.31a352.80±76.09a复视明胶囊中剂量组10361.90±60.78a361.80±65.50a356.70±79.99a370.80±82.10a383.10±85.51a复视明胶囊低剂量组10(1#)332.11±55.22a357.33±58.91a362.44±64.90a361.56±65.57a375.44±66.39a

注：#表示死亡例数；与空白组比较aP<0.01。

4.3血糖值变化 大鼠腹腔注射STZ后第8周血糖值显著升高，与空白对照组比较，P<0.01；动物分组并治疗4周后，模型组血糖值仍维持在第8周时水平；而复视明胶囊中剂量组血糖值明显降低(P<0.05)。见表2。

表2不同时间大鼠血糖的变化

Tab.2 The change of rat random blood glucose during experiments

分组n0周8周12周空白组105.86±0.616.42±0.41 5.60±0.22模型组10(1#)5.86±0.6128.99±3.52a29.99±2.50a阳性对照组10(1#)5.86±0.6130.59±1.96a31.73±1.75a复视明胶囊高剂量组105.86±0.6129.49±3.30a32.08±1.64a复视明胶囊中剂量组105.86±0.6128.40±2.84a26.51±2.61a,b,c复视明胶囊低剂量组10(1#)5.86±0.6128.49±2.69a29.16±2.75a,c

注：#表示死亡例数；与空白对照组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与阳性对照组比较cP<0.05。

4.4血清NOS和T-SOD活力 空白对照组大鼠NOS和T-SOD值明显高于模型组；复视明胶囊高、中剂量组NOS活力值均显著升高(P<0.05);复视明胶囊中、低剂量组SOD活力均明显升高(P<0.05)。见表 3。

表3血清NOS和T-SOD活力的测定结果

Tab.3 The changes of rat NOS and T-SOD levels during experiments

分组nNOST-SOD空白对照组1020.52±4.07 27.86±6.46模型组10(1#)4.05±1.17a10.67±3.23a阳性对照组10(1#)11.29±5.95a,b21.75±6.36a,b复视明胶囊高剂量组1013.50±6.15a,b 11.42±2.23a复视明胶囊中剂量组109.73±1.82a,b25.38±6.87b复视明胶囊低剂量组10(1#)5.29±1.94a,c19.00±5.15a,b

注：#表示死亡例数；与空白对照组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与阳性对照组比较cP<0.05。

4.5ERG变化 给药前模型组暗适应视杆细胞反应b波和暗适应振荡电位OS2波幅显著下降(P<0.01)，说明DR早期造模成功。见表4和图1。

图1振荡电位OS2波对比

A.空白对照组；B.模型组。

Fig.1 Comparison of OS2 of oscillatory potentials

A.blank control group；B.model group.

表4给药前(注射STZ8周后)各组暗适应视杆细胞反应b波、暗适应最大混合反应a波和b波、暗适应振荡电位OS2波、明适应视锥细胞反应b波和明适应30Hz闪烁反应的幅值的比较

分组n暗适应视杆细胞反应b波暗适应最大混合反应a波暗适应最大混合反应b波暗适应振荡电位OS2波明适应视锥细胞反应b波明适应30 Hz闪烁反应空白对照组1066.66±35.7973.02±32.86136.98±73.9138.27±11.9133.84±11.4610.36±5.77造模组30(30/50)47.09±24.36a63.16±25.68110.54±54.2423.22±9.64a26.79±11.047.13±4.35

注：与空白对照组比较aP<0.01。

试药治疗4周后，相比于空白对照组，模型组的暗适应视杆细胞反应b波、暗适应最大混合反应b波、暗适应振荡电位OS2波、明适应视锥细胞反应b波及明适应30 Hz闪烁反应的幅值下降均具有统计学意义(P<0.05)。相比于模型组，复视明胶囊中剂量组有增加暗适应视杆细胞反应b波幅值的作用(P<0.05)，阳性对照组和复视明胶囊高剂量组、复视明胶囊低剂量组具有改善趋势；复视明胶囊高剂量组有增加暗适应最大混合反应b波幅值的作用(P<0.05)，阳性对照组和复视明胶囊中、低剂量组具有改善趋势；复视明胶囊高、中剂量组有增加明适应视锥细胞反应b波幅值的作用(P<0.05)，阳性对照组和复视明胶囊低剂量组具有改善趋势；阳性对照组有增加明适应30 Hz闪烁反应幅值的作用(P<0.05)，复视明胶囊高、中和低剂量组具有改善趋势；复视明胶囊高、中剂量组有增加暗适应振荡电位OS2波幅值的作用趋势。见表5及图 2。

表5治疗4周后各组暗适应视杆细胞反应b波、暗适应最大混合反应a波和b波、暗适应振荡电位OS2波、明适应视锥细胞反应b波、明适应30Hz闪烁反应的幅值的比较

分组n暗适应视杆细胞反应b波暗适应最大混合反应a波暗适应最大混合反应b波暗适应振荡电位OS2波明适应视锥细胞反应b波明适应30 Hz闪烁反应空白对照组1067.44±29.6674.09±28.15144.12±45.4235.09±8.4933.23±6.199.89±3.20模型组10(1#)40.04±23.81a56.59±28.10 83.79±41.07a18.39±9.63a21.46±8.75a6.74±2.79a阳性对照组10(1#)46.17±20.0770.51±29.77115.28±21.1620.29±10.14a29.78±6.399.68±2.46b复视明胶囊高剂量组1051.62±27.3261.03±18.01126.03±45.35b26.71±11.9631.16±12.53b8.08±2.26复视明胶囊中剂量组1063.05±26.64b60.91±28.07113.09±49.4324.99±16.7830.41±10.04b8.01±3.18复视明胶囊低剂量组10(1#)46.33±20.4158.62±23.95109.99±53.7220.82±13.54a27.77±11.197.95±3.62

注：#表示死亡例数；与空白对照组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05。

图2视杆细胞反应b波对比

A.空白对照组；B.模型组。

Fig.2 Comparison of b-welle of cone-response

A.blank control group；B.model group.

4.6FFA变化 大鼠腹腔注射STZ 8周，造模组出现弥散性毛细血管迂曲扩张(见图3B-1)，背景荧光增强(见图3B-1至B-3)及显影困难(见图3C-1至C-3)，12周后模型组白内障发病率显著增高，而阳性对照组和复视明胶囊高、中、低剂量组DR病变日趋加重并亦发生白内障等，导致无法实施眼底荧光血管造影观察；但空白对照组显影清晰，沿眼球后部中央的视神经盘发出6～8根细而直的动脉，伴行6～8根较粗的视网膜静脉，如图3A-1至3A-3所示，未观察到微动脉瘤、硬性渗出、出血斑、棉绒斑和黄斑性水肿等病理改变。

图3大鼠腹腔注射STZ8周后眼底荧光血管造影

A.1～3.空白对照组；B.1～3.糖尿病模型组；C.1～3.糖尿病模型组。

Fig.3 Fundus fluorescein angiography of rats after ip.STZ for 8 weeks

A.1-3.blank control group；B.1-3.diabetes model group;C.1-3.diabetes model group.

4.7白内障检出率 大鼠腹腔注射STZ 8和12周(试药治疗4周)分别行裂隙灯眼前节照相检查，空白对照组均正常。第8周时模型组3只大鼠单眼白内障。12周时模型组6只大鼠双眼、3只单眼白内障，其发生率达75%；阳性对照组3只双眼、2只单眼白内障；复视明胶囊高剂量组2只双眼、4只单眼白内障；复视明胶囊中剂量组4只双眼、3只单眼白内障；复视明胶囊低剂量组5只双眼、4只单眼白内障。见图4。由图4可知，空白对照组，角膜透明，前房清晰，晶状体无浑浊。模型组、阳性对照组、复视明胶囊高、中、低剂量组存在不同程度的眼部病变，可见云状或浑浊。复视明胶囊治疗4周，高、中剂量组可明显降低DR白内障发生率(P<0.05)，具有明显量效关系。见表6。

图4大鼠眼部裂隙灯检查

N：空白对照组；DM：模型组；C：阳性对照组；T1：复视明胶囊高剂量组；T2：复视明胶囊中剂量组；T3：复视明胶囊低剂量组。

Fig.4 Slit-lamp examination of rats(12 weeks)

N.blank control group;DM.model group;C.positive control group; T1.Fushiming Capsules high-dose group;T2.Fushiming Capsules middle-does group;T3.Fushiming Capsules low-does group.

表6第12周各组患白内障情况

Tab.6 The condition of cataract by the 12 week

组别轻微白内障严重白内障发病率/%*空白对照组(20)000模型组(18)31275阳性对照组(18)3536b复视明胶囊高剂量组(20)4430b复视明胶囊中剂量组(20)6540b复视明胶囊低剂量组(18)41066

注：与模型组比较bP<0.012 5。

轻微白内障指病情如图4中的C-1，C-2，T1-1，T1-2 和 T2-1；严重白内障指病情如图4中的DM-1，DM-2，T2-2，T3-1 和 T3-2。(这种分级并非用于临床，但可以简单有效地描述白内障的病况)；*计算公式:(轻微/2+严重)/眼数×100%。

5 小结与讨论

大鼠腹腔注射STZ后8周，在持续高血糖的情况下，检测视网膜ERG和眼底FFA等一系列指标可观察到其病理日趋加重直至诱发白内障的全过程，这不仅说明大鼠DR造模成功，还为探讨白内障的发病机制和筛查防治药物提供了方法和理论支持。

文献表明，振荡电位OS2波振幅越低则DR越严重，而b波是一个灵敏而可靠的诊断视网膜功能的客观指标[10-11，15-16]。实验采用ERG、FFA、弥散光照明和血糖监测等方法，证实复视明胶囊高、中剂量组治疗4周能明显增加暗适应视杆细胞反应b波、暗适应最大混合反应b波和明适应视锥细胞反应b波幅值，有增加暗适应振荡电位OS2波幅值的趋势，并明显降低白内障发生率，提示复视明胶囊具有治疗DR的作用。眼前节相片是观察眼部浑浊弥散于核及皮层发展过程的重要方法，实验观察到大鼠腹腔注射STZ直至12周，模型组由部分浑浊到完全浑浊，最初于后囊下出现典型的白点状或雪片状的浑浊，然后随着病程迅速扩展为完全性的白内障全程。为了更清楚地评价试药的治疗效果，将其眼部白内障的患病程度区分为轻度和重度，以利于较客观的描述药物控制病情发展的作用。

DR可与视网膜微动脉瘤、硬性渗出、出血斑、棉绒斑、视网膜静脉病变、新生血管和视网膜前及玻璃体出血等互为因果[2，4]。FFA能清晰地显现动态视网膜循环和细微的血管结构，观察其循环及渗漏以发现血管功能及其结构上的病变部位及程度[3]。本实验能清晰观察到空白组大鼠眼底细微血管结构及动态循环，模型组大鼠出现弥散性毛细血管迂曲扩张和背景荧光增强等现象，但未观察到微动脉瘤、硬性渗出、出血斑、棉绒斑、黄斑性水肿、荧光素渗漏和视网膜新生血管等的改变，这可能与大鼠持续高血糖、DR晚期病变过于严重或病变发展快速，短期内形成了血管内严重阻塞导致造影困难而无法观测所致。

已有研究表明[17-22]，NOS是一种重要的血管活性物质，可以影响眼底微循环血流动力学，能够阻止白细胞和血小板对血管壁造成的损害，阻止血管平滑肌细胞增殖和迁移，使血管内皮不受损伤；血管内皮细胞结构和功能受损，NOS合成和分泌减少从而引起机体调节血管、血压、血小板凝聚、参与细胞信息传递和内分泌等功能减弱。SOD是体内重要的抗氧化酶，能保持机体氧化和抗氧化系统的平衡，提高人体内SOD的有效值，可降低糖尿病血管并发症的损伤。研究证实，复视明胶囊具有增强NOS和T-SOD活力的作用，这提示该实验对视网膜微血管的保护作用可能通过抗氧化应激诱导。

综上所述，复视明胶囊能降低血糖，改善DR大鼠的视网膜电生理功能，降低白内障的发病率，提高T-SOD与NOS活力，提示复视明胶囊对DR具有治疗作用，其机制可能与抗氧化应激有关但其治疗DR作用的确切机制有待进一步研究。