BMP2信号转导通路在特发性高钙尿大鼠肾结石形成中的调控作用

白栩搏

(冀中能源邢台矿业集团总医院泌尿外科，邢台 054000)

肾结石是泌尿外科常见病之一，严重威胁人类健康[1]。目前对肾结石的发病机制仍不完全清楚。特发性高钙尿(idiopathic hypercalciuria，IH)是临床常见的代谢异常，也是草酸钙结石的主要危险因素[2]。调查显示[3]，成人IH发病率为5%～8%，而合并IH的人群尿结石发病率是正常人群的5倍。尽管已知IH是肾结石的高危因素，但其在肾结石形成中的作用及机制尚不清楚。国外最新研究显示[4]，骨形成蛋白(bone morphoenetic protein，BMPs)与成骨分化和骨质形成有关，其中骨形成蛋白2(BMP2)信号通路参与调控的异位钙化是多种结石的主要诱导因素。BMP2、成骨细胞特异性转录因子2(runt-related protein 2，RUNX2)、肌肉片段同源盒2(muscle segment homeobox 2，MSX2)和锌指结构转录因子(osterix，Osx)均是BMP2信号通路中的重要转录因子，且上述转录因子在血管钙化部位呈高表达。因此，本研究利用高钙尿模型大鼠，研究BMP2信号转导通路在肾结石形成中的调控机制。

1 仪器与试药

1.1仪器 凝胶成像分析系统(郑州博邦公司)；DYY-10C电泳仪(北京六一仪器公司)；7500定量PCR仪(美国Thermo fisher公司)；RM2235石蜡切片机(德国徕卡仪器有限公司)。

1.2试药 Von Kossa钙染色试剂盒，购自上海舜田生物科技有限公司；兔抗大鼠BMP2抗体、兔抗大鼠MSX2抗体、兔抗大鼠RUNX2抗体和兔抗大鼠Osx抗体，均购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠二抗，购自武汉博士德生物工程公司；β-actin购自上海北诺生物科技有限公司；RIPA裂解液，购自北京碧云天生物技术有限公司；RNA提取试剂Trizol，购自美国Invitrogen公司；实时定量PCR反应液SYBR Green Ⅰ premix，购自日本TaKaRa公司；cDNA第一链合成试剂盒，购自Thermo Fisher Scientific公司。

2 方法

2.1大鼠分组 20只清洁级遗传性高钙尿结石大鼠(GHS组)和20只体质量、月龄配对的健康清洁级SD大鼠(对照组)，均购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，大鼠3月龄，体质量200±20 g。大鼠于12 h光照/12 h黑暗条件下饲养，适用性喂养1周后开始实验。本研究取得实验动物伦理委员会批准，严格按照科技部《关于善待实验动物的指导性意见》[5]的相关要求进行操作。

2.2样本采集 2组大鼠适用性喂养1周后，腹腔注射质量浓度为20 g·L-1的戊巴比妥钠3 mL·kg-1全身麻醉，无菌操作下将腹膜切开，完全切下肾脏组织，液氮中保存待用。

2.3Von Kossa钙染色 从液氮中取出肾脏组织，用PBS缓冲液冲洗3次，用质量浓度为0.4 g·L-1的多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，制成厚度4 μm的连续切片。石蜡切片脱蜡至水。加入质量浓度为5 g·L-1的硝酸银溶液1 mL，紫外光灯下照射1 h。双蒸水冲洗3次，加入1 mL质量浓度为50 g·L-1的硫代硫酸钠溶液处理5 min，吸出残液。自来水反复冲洗，加入2滴核固红染液复染10 min，蒸馏水冲洗后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，室温下晾干后中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

2.4蛋白质印迹法(Western Blot法)检测BMP2、MSX2、RUNX2和Osx的蛋白表达 液氮中取出肾脏组织，用手术剪将肾脏组织剪成小块，置于匀浆器中，加入1 mL RIPA裂解液，冰浴上提取总蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒检测总蛋白质量分数。取50 μg总蛋白和等体积的上样缓冲液，SDS-PAGE电泳分离，常规湿法转膜，加入质量浓度为5 g·L-1的脱脂牛奶孵育封闭1.5 h。用封闭液稀释相应的一抗：BMP2(1∶500)、MSX2(1∶200)、RUNX2(1∶200)和Osx(1∶300)，将PVDF膜浸于一抗的稀释液中，4 ℃孵育过夜。用PBS缓冲液冲洗PVDF膜3次，再加入HRP标记的二抗(1∶20 000稀释)，室温振荡2 h。ECL化学发光显影试剂盒显影，以β-actin作为内参照，扫描目的条带和内参条带，使用Image J软件对条带进行分析，计算目的条带的相对表达量。

2.5实时定量PCR(RT-PCR)检测BMP2、MSX2、RUNX2和Osx mRNA表达 取50 mg肾脏组织，液氮中用研钵将组织充分研成粉末，置于匀浆器中，加入1 mL Trizol提取试剂冰浴上孵育5 min，4 ℃下以5 000 r·min-1离心5 min，抽取上清液，加入150 μL氯仿充分振荡孵育5 min，同样条件下离心10 min，取上层液。加入400 μL异丙醇冰浴振荡5 min，4 ℃下以5 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液；沉淀用体积分数为70%的乙醇洗涤3次，紫外分光光度计检测260和280 nm处吸光度的比值，确定总RNA浓度。根据逆转录反应试剂盒说明书，将总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。采用Primer Premeir 5.0软件设计引物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列见表1。PCR反应体系：上下游引物各0.2 μL，SYBR Green Ⅰ premix 12 μL，双蒸水5.6 μL，cDNA 2 μL，总反应体系20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性15 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，总计40个循环。反应结束后直接读取Ct值，以β-actin作为内参，按照2-△△Ct值计算目的基因相对表达量。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)-(Ct对照基因-Ct β-actin)。

表1引物序列

Tab.1 The primer sequence

引物名称引物序列BMP2引物上游:5'-GGCTGAGGGTTAGTGAGCA-3'序列下游:5'-AGGGAGTTGGTGAAAGACATC-3'MSX2引物上游:5'-AGGGCAGAATCATGAGCAAGT-3'序列下游:5'-AGGGTCTGCATTGGATGGCA-3'RUNX2引物上游:5'-CAGGCATTTCATCCCTCACT-3'序列下游:5'-TATGGAGTGCTGCTGGTCTG-3'Osx引物上游:5'-CCAAGGCAGTTGGCAATAGT-3'序列下游:5'-ATGAATGGGCTTCTTCCTCA-3'β-actin引物上游:5'-CACCATTGGCAATGAGGGGTTC-3'序列下游:5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'

3 结果

3.1肾脏组织Von Kossa钙染色结果 利用Von Kossa染色法检测2组大鼠钙盐沉积情况，见图1。由图1可知，GHS组大鼠肾间质中有明显的钙盐沉积(钙盐被硝酸银染成黑色)；而对照组大鼠肾间质则未见钙盐沉积情况。

图1大鼠肾间质VonKossa钙染色结果(×200)

A.对照组；B.GHS组。注：箭头表示钙盐沉积。

Fig.1 The Von Kossa calcium staining in rat renal interstitium (×200)

A.control group；B.GHS group.Note:the arraw indicates calcium deposition.

3.2肾脏组织BMP2、MSX2、RUNX2和Osx mRNA表达 RT-PCR检测结果显示，GHS大鼠BMP2、MSX2、RUNX2和Osx mRNA表达水平明显高于对照组，2组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2RT-PCR检测BMP2、MSX2、RUNX2和OsxmRNA在大鼠肾脏组织中的表达

A.BMP2 mRNA表达；B.MSX2 mRNA表达；C.RUNX2 mRNA表达；D.Osx mRNA表达。*P<0.05，**P<0.01：GHS组vs对照组。

Fig.2 The expression of BMP2，MSX2，RUNX2 and Osx mRNA in rat renal tissues detected by RT-PCR

A.the expression of BMP2 mRNA；B.the expression of MSX2 mRNA；C.the expression of RUNX2 mRNA；D.the expression of Osx mRNA.*P<0.05，**P<0.01：GHS group vs control group.

3.3肾脏组织BMP2、MSX2、RUNX2和Osx蛋白表达 与RT-PCR结果一致，Western Blot检测结果显示，GHS大鼠肾脏组织BMP2、MSX2、RUNX2和Osx蛋白明显高于对照组，2组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3WesternBlot检测BMP2、MSX2、RUNX2和Osx蛋白在大鼠肾脏组织中的表达

A.BMP2蛋白表达；B.MSX2蛋白表达；C.RUNX2蛋白表达；D.Osx蛋白表达。**P<0.05，**P<0.01：GHS组vs对照组。

Fig.3 The expression of BMP2，MSX2，RUNX2 and Osx protein in rat renal tissues detected by Western Blot

A.the expression of BMP2 protein；B.the expression of MSX2 protein；C.the expression of RUNX2 protein；D.the expression of Osx protein.*P<0.05，**P<0.01：GHS group vs control group.

4 讨论

泌尿结石是最常见的泌尿系统疾病，多数患者发病年龄为30～45岁，且发病呈年轻化趋势[6]。研究发现[7]，40%以上的肾结石患者尿钙明显升高，这种升高机制可能与消化道钙吸收增加、肾脏重吸收受限以及骨重吸收有关。张彬等[8]报道证实，IH是泌尿结石的危险因素之一，具有明显的遗传特点。IH与遗传性高钙尿(GHS)具有相似的生理病理特征，即血清钙在正常范围内，但肾小管对钙重吸收减弱导致尿钙增加，进而自发形成结石，且这种结石的形成仅与遗传有关[9]。因此，GHS被认为是研究IH理想的动物模型。近年来研究报道[10]，IH大鼠肾间质存在明显钙化现象，特别是已形成肾结石者，肾间质钙化尤为明显。本研究利用Von Kossa钙染色法检测大鼠肾组织的钙盐沉积情况，结果显示，GHS组大鼠肾间质中存在明显的钙盐沉积，而对照组大鼠肾间质无钙盐沉积现象。这一结果提示，GHS可能在某种调控作用下形成结石。然而关于高钙尿对肾结石形成的调控机制尚不清楚。

国外最新研究表明[11]，结石形成的诱因：异位钙化与骨矿化过程具有相似的调控过程。BMPs属于TGF-β超家族成员之一，也是参与骨合成的重要代谢因子。BMPs与特异性受体结合后，通过调控下游靶基因的转录，诱导机体发生异位钙化。BMP2与异位钙化的关系最为密切，机体在一系列外界刺激下，诱导间充质前体细胞分泌BMP2，并激活BMP2介导的信号通路调控前体细胞分化为成骨样细胞，并促进基质矿化[12]。BMP2信号通路包括BMP2、MSX2、RUNX2和Osx转录因子，也是骨骼形成的重要调控因子。Kee H J等[13]报道，BMP2通过Smad信号通路诱导MSX2和RUNX2表达上调，其中RUNX2是Osx的上游调控基因，参与骨细胞的形成、分化。刘光源等[14]则证实，MSX2高表达能够上调间充质细胞Osx表达，且这种高表达特异性贯穿于整个骨形成过程。Osx是含有特殊锌指结构的转录因子，也被证实参与调控成骨分化和骨形成。Shrivats A R等[15]利用siRNA技术沉默小鼠Osx基因表达，结果显示，干扰组小鼠软骨发育出现明显异常，表现为软骨骨化受阻。

本实验利用GHS大鼠模型研究BMP2信号通路在肾结石形成中的调控作用，结果显示，BMP2、MSX2、RUNX2、Osx蛋白和mRNA表达均明显高于对照组大鼠，提示GHS可能通过激活BMP2信号通路诱导肾结石的形成。田晶等[16]报道，GHS大鼠肾脏组织维生素D受体(VDR)和BMP2表达上调，并调节肾间质钙化。研究表明[17]，肾间质异位钙化向肾乳头延伸，诱导尿钙晶体聚集黏附，最终出现钙盐沉积而形成结石。Cao H等[18]报道,VDR是BMP2信号通路的激活诱因，在血管钙化方面发挥关键作用。本研究限于篇幅，尚未检测2组大鼠VDR表达水平，这也是未来研究的方向之一。

综上所述，本研究初步证实了高钙尿通过激活BMP2信号通路调控肾结石的形成，此结果为研究肾结石的发病机制指明了新方向。