狗脊多糖对硝普钠诱导退变大鼠软骨细胞氧自由基影响的研究

付长龙 梅阳阳 李民 黄志强 黄艳峰 林晴 郑春松 叶锦霞

【摘 要】目的：觀察狗脊多糖对硝普钠（SNP）诱导退变大鼠软骨细胞氧自由基的影响，为其在骨关节炎的临床应用提供理论依据。方法：采用水提醇沉法、Sevag法除蛋白提取纯化获得狗脊多糖，苯酚-硫酸比色法测定其多糖含量；酶联免疫吸附测定法分别检测体外培养大鼠软骨细胞空白对照组、模型对照组、各剂量狗脊多糖组（100，200，400，800 μg·mL-1）的超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的含量。结果：狗脊多糖含量为76.91%，精密度试验RSD = 1.86%，表明仪器精密度良好，且稳定性试验RSD = 1.98%，平均回收率试验为95.4%，RSD = 1.83%；酶联免疫吸附法检测经SNP造模后软骨细胞氧自由基表达结果显示，与空白对照组比较，模型对照组SOD、NO、MDA含量表达差异均有统计学意义（P < 0.01），提示软骨细胞退变模型建立；与模型对照组比较，各剂量狗脊多糖组（100，200，400，800 μg·mL-1）干预48 h后，可上调SOD含量，下调NO、MDA含量，其中以200 μg·mL-1组表达最显著（P < 0.01）。结论：苯酚-硫酸比色法可作为狗脊多糖的含量测定方法；狗脊多糖可降低经SNP造模后软骨细胞中异常氧自由基含量表达，上调抗氧化因子水平，发挥抗氧化作用。

【关键词】 骨关节炎，膝；狗脊多糖；软骨细胞；氧自由基；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effects of Rhizoma Cibotii polysaccharides on oxygen free radicals in rats' degenerative chondrocytes induced by sodium nitroprusside（SNP）and provide a theoretical basis for its clinical application in osteoarthritis.Methods：Polysaccharide was extracted and purified with water extraction and Sevag methods，and the polysaccharide content was determined by the phenol sulfuric acid colorimetry.The enzyme linked immunosorbent assay was used to detect the contents of superoxide dismutase（SOD），nitric oxide（NO）and malondialdehyde（MDA）respectively in the blank group，the model group and the Rhizoma Cibotii polysaccharides group（100，200，400，800 μg·mL-1）.Results：The Rhizoma Cibotii polysaccharide content was 76.91% and the precision experiment showed RSD = 1.86%，which showed that the precision of the instrument was good.The stability test showed RSD = 1.98%，the average recovery test was 95.4%，and RSD was 1.83%.The enzyme linked immunosorbent assay showed that the differences between the contents of SOD，NO and MDA in the model group and thosein the blank group were statistically significant（P < 0.01），suggesting that the chond-rocyte degeneration model was established.Compared with the model group，after the intervention to the experimental group（100，200，400，800 μg·mL-1）for 48 h，the contents of SOD could be up regulated and the content of NO and MDA could be down regulated，with the group of 200 ?g·mL-1 the most significant（P < 0.01）.Conclusion：The phenol sulfuric acid colorimetry can be used to determine the content of the Rhizoma Cibotii polysaccharide.Rhizoma Cibotii polysaccharide can reduce the expression of the abnormal oxygen free radical content in the chondrocytes after the SNP model，up-regulating the level of antioxidant factors and playing an antioxidant role.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；Rhizoma Cibotii polysaccharide；chondrocytes；oxygen free radicals；rats

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种主要由生物学因素及力学异常影响下导致关节软骨渐进退变的慢性关节疾病。目前，在全球范围内KOA发病形势严峻，患病人口众多，其临床常以关节部位的疼痛、关节僵硬等症状伴随始终，具有很高的致残率[1-3]。鉴于当前缺乏从根本上治疗和延缓病程的有效手段，因此，寻找一种安全、适用、便捷的治疗方法是今后治疗追求的目标。中医学对KOA的治疗认识古已有之，治疗方法丰富多样，具有较高安全性、方便经济特点，且临床具有良效[4]。鉴于KOA的根本病机是本虚标实，因此，施以补肾柔肝，兼以祛风、除湿作用的中药，方切合其治则[5]。

近年来，研究发现中药多糖可有效抑制KOA的发生和发展，中药多糖能够改善局部微循环，降低骨内压、改善滑膜炎症、调节异常细胞因子含量表达及发挥对软骨细胞凋亡的抑制作用，从而可在一定程度上有效抑制KOA的发生和发展[6]。而狗脊多糖是从中药狗脊中提取的活性物质，前期研究发现，其对软骨细胞活性具有正向调控作用[7]。因此，本研究进一步研究其对SNP诱导大鼠软骨细胞退变模型氧自由基的影响，为探讨其作用机制提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物和药物 健康SD雄性大鼠16只（清洁级），体质量约为90 g，饲养环境终年维持温度23～25 ℃，湿度55%～60%，每小时换风16次，12 h光照/12 h黑暗自动控制循环光照条件。上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2007-0005。制狗脊由福建省尤溪仙锦药业有限公司提供。

1.2 主要试剂 D-无水葡萄糖（中国食品药品检定研究院，批号110833-201104）；磷酸盐缓冲液（美国HyClone公司，批号NZM1284）；DMEM/LOW GLUCOSE（美国HyClone公司，批号NZK1239）；SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20140606）；NO试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20140528）；MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20140527）等。

1.3 主要仪器 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；紫外分光光度计（岛津公司）；Bio-tek酶标仪（美国Bio-Tek公司）；低温高速离心机（美国BECKMAN，64R型）；无菌操作台（苏州安泰空气技术有限公司，AIRTECH型）。

2 方 法

2.1 狗脊多糖的提取 稱取狗脊药材50 g，依次经粉碎、筛检、脱脂（石油醚），提取1次，提取2次（均为10倍体积蒸馏水/次/2 h），收集提取液2次，抽滤减压，浓缩体积至300 mL，后入乙醇（3倍体积）静置过夜。次日依次经离心沉淀，干燥凝集（初获粗多糖），Sevag法（筛除蛋白成分），950 mL·L-1乙醇分级沉淀，高速离心收集沉淀，洗涤（依次使用无水乙醇、丙酮、乙醚），经低温干燥即为狗脊多糖。

2.2 苯酚-硫酸比色法检测狗脊多糖的含量

2.2.1 最大吸收波长的选择 先以50 mL蒸馏水为母液，混匀溶解准确称取的无水葡萄糖0.01 g，重复上一步操作并以蒸馏水：无水葡萄糖为25 mL∶0.01 g的量值再次配制其混合液，此即为葡萄糖标准液。然后混匀含有0.1 mL（100 μL）葡萄糖标准液及0.9 mL（900 μL）蒸馏水的混合液，依次加入1 mL质量分数为5%的苯酚、5 mL浓硫酸后置于沸水15 min，冰水15 min反应，经紫外分光仪检测确定其最大吸收峰值波长。

2.2.2 葡萄糖标准曲线的制作 依次精密吸取葡萄糖标准液0.1，0.3，0.5，0.6，0.7，0.9，1.0 mL后分别加入7支试管中，加水稀释至1.0 mL，依

次加入1 mL质量分数为5%的苯酚、5 mL浓硫酸后反应30 min。对比检测空白对照组（蒸馏水）、葡萄糖标准液组在490 nm波长时的吸光度值（OD），分别以吸光度值A和葡萄糖质量分数C（mg·mL-1）为纵横标位，绘制标准曲线方程。

2.2.3 狗脊多糖的含量测定 先以50 mL蒸馏水为母液，混匀溶解准确称取的狗脊多糖粉末0.01 g，重复上一步操作并以蒸馏水∶无水葡萄糖为25 mL∶0.01 g的量值再次配制其混合液，此即为狗脊多糖供试液。取供试液1.0 mL，依次加入1 mL苯酚（质量分数5%）、5 mL浓硫酸反应后经比色检测其吸光度A，则狗脊多糖浓度C即可由标准曲线方程计算得出。

2.3 软骨细胞的分离和培养及鉴定

2.3.1 软骨细胞的分离和培养 其步骤依次为：人工处死大鼠每次3只（经行脱颈锥式），浸泡消毒；离断至双侧膝关节以上骨骼，PBS缓冲液冲洗净，再次浸泡消毒；暴露关节腔，按层次分离关节软骨，集中后经剪碎处理（1 mm3/单位体积），PBS缓冲液冲洗3遍及以上，质量分数为0.2%Ⅱ型胶原酶消化，无菌试管收集消化后的上清液（每次2 h，重复3次），高速离心后弃上清液；移液器代液（细胞培养液）状态轻柔吹打沉淀，计数板计数（2×105·mL-1），种植原代细胞于培养瓶进行孵化培养；48 h后初次换液，镜下观察细胞铺满绝大数瓶底面积，PBS缓冲液冲洗倒净，胰酶消化进行传代培养，此时标为第1代软骨细胞。以同样方法传至第3代细胞，镜下观察比较分析后，选取状态及活性最佳的第2代软骨细胞进行后续实验。

2.3.2 软骨细胞鉴定 甲苯胺蓝染色法：使用经高压蒸汽消毒后的齿镊轻柔夹持无菌盖玻片转移至6孔板孔中央部，以其为载体培育软骨细胞（计数2500个·mL-1），待爬片后，冲洗（PBS）3遍；固定30 min（质量分数为4%中性多聚甲醛），再次冲洗（PBS）3遍；染色（1%甲苯胺蓝）10 min，第3次冲洗（PBS）3遍；漂洗至无深蓝色（蒸馏水），再漂洗（无水乙醇）1次，常温风干后封片，观察与鉴定（光学显微镜）。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：使用经高压蒸汽消毒后的齿镊轻柔夹持无菌盖玻片转移至6孔板孔中央部，以其为载体培育软骨细胞（计数2500个·mL-1），待爬片后，冲洗（PBS）3遍；固定30 min（质量分数为4 %中性多聚甲醛），再次冲洗（PBS）3遍；裂解（质量分数为0.1 %破膜剂50 μL） 20 min，第3次冲洗（PBS）3遍；50 μLH2O2（质量分数为3 %）反应20 min，第4次冲洗（PBS）3遍；封闭（质量分数5 % BSA）30 min后，阳性组一抗反应过夜（Ⅱ型胶原1∶200），阴性组用PBS代替，第5次冲洗（PBS）3遍；50 μL体积二抗（羊抗兔1∶200）反应30 min，第6次冲洗（PBS）3遍；DAB浸润玻片（每次50 μL）反应10 min，流水漂洗3遍（每次5 min），苏木素复染，第7次冲洗（PBS）3遍；迅速返蓝（质量分数为5 %盐酸乙醇溶液）2 s，常温晾干，梯度酒精脱水，二甲苯透明梯度，封片（中性树脂），观察与鉴定（光学显微镜）。

2.4 退变软骨细胞模型的复制 选取第2代软骨细胞，经计数后，调整细胞悬液计数为2×104·mL-1，使用移液枪将其接种于洁净培养瓶（4 mL），放置于37 ℃培养箱中（体积分数为5%的CO2）进行孵育细胞，每隔24 h更换1次培养液，待软骨细胞沿瓶壁生长占满约90%的空间时，按本课题组前期造模方式[7]，加入1 mM SNP干预软骨细胞24 h后成模。

2.5 酶联免疫吸附法测试SOD、NO、MDA的含量 选取第2代软骨细胞，按每孔1×105个·mL-1的密度接种于洁净6孔板，设置空白对照组、模型对照组、狗脊多糖組。空白对照组：向每孔加入DMEM（体积分数为10 %的胎牛血清）2 mL培养24 h后，换新每孔2 mL的DMEM液依次加入后继续培养48 h。模型对照组：每孔中加入1 mM（1000 ng·mL-1）SNP的培养基2 mL 作用24 h后，更换新含10 %胎牛血清的DMEM 2 mL继续培养48 h。狗脊多糖组：孔中加入剂量为

1 mM（1000 ng·mL-1）的SNP的培养基2 mL作用24 h后更换为不同质量分数的狗脊多糖2 mL（100，200，400，800 μg·mL-1） DMEM继续培养48 h（狗脊多糖的最佳时效-量效关系为48 h与200 μg·mL-1，依据前期研究[7]）。将各组细胞液收集到离心管，离心机以1500 r·min-1离心2次后收集上清液，依实验所需进行分装后储存于-80 ℃冰箱备用。按照各指标试剂盒说明书，其中NO、SOD、MDA的定量检测分别以硝酸还原酶法、黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）、硫代巴比妥法（TBA）进行操作。

2.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以表示，2组间比较采用t检验与单因素方差分析；计数资料采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 苯酚-硫酸比色法测定结果

3.1.1 最大吸收波长的确定 制备标准品溶液与空白对照组溶液，操作如前，经紫外线200～800 nm范围内检测，结果表明最大吸收波长为484 nm。

3.1.2 葡萄糖标准曲线绘制 标准曲线回归方程为：Y = 0.0672 X + 0.0157，R2 = 0.9994，说明葡萄糖在1～11 μg·mL-1范围内线性关系良好。

3.1.3 精密度、稳定性及加样回收率试验 精密度试验：精密吸取标准品溶液0.5 mL，加蒸馏水至1.0 mL，按苯酚-硫酸法操作在最大吸收波长处平行测定6次，A值分别为0.443 8，0.432 9，0.439 6，0.442 9，0.438 2，0.422 0，RSD = 1.86%，表明仪器精密度良好。稳定性试验：精密吸取标准品溶液0.5 mL，加蒸馏水至1.0 mL，按苯酚-硫酸法操作，在最大吸收波长处每隔30 min测1次，共测6次，A值分别为0.423 6，0.432 3，0.419 6，0.421 9，0.409 2，0.412 0，RSD = 1.98 %。加样回收率试验：取样品溶液6份，每份均为0.4 mL，依次向每份溶液中加入葡萄糖标准品溶液0.3 mL，加入蒸馏水至

1 mL，按苯酚-硫酸法操作，于484 nm处测定其吸光度，计算平均回收率为95.4 %，RSD = 1.83%。

3.1.4 狗脊多糖样品含量测定 取供试液1.0 mL，使用移液枪加入质量分数为5 %的苯酚1 mL进行混匀，再迅速紧贴管壁滴加5 mL浓硫酸，经缓慢振荡混匀，比色检测吸光度A，由回归方程求出经Sevag法除蛋白后的狗脊多糖含量为76.91%。

3.2 软骨细胞形态学特征及鉴定

3.2.1 软骨细胞形态学特征 镜下观察细胞外观形态近似圆形，大小基本一致，且遮光性强为原代软骨细胞；接种24 h后大多数软骨细胞开始紧贴壁生长，形似扁平状，胞浆丰富，胞核清晰，具有1～2个核仁，见图1（1）；培养3 d后，软骨细胞开始聚集重叠并沿瓶壁扩散生长，呈现“簇团样”集聚，外观以圆形或椭圆形为主，见图1（2）；5 d后细胞分布均匀，边界清晰，形态结构一致，呈明显的铺路石状外观，见图1（3）；本实验使用第2代软骨细胞因其生长状态良好，细胞分泌基质的能力较强，增殖速度较快，见图1（4）。

3.2.2 甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化鉴定结果 经甲苯胺蓝染色后，正常软骨细胞镜下显示其细胞核被染成蓝色，细胞间质及胞浆均被染成紫红色；经Ⅱ型胶原染色后，阴性组胞浆区颜色透明，阳性组胞浆区为棕黄色，由上可鉴定本实验所用细胞为软骨细胞。见图2。

3.3 酶联免疫吸附测定法测试SOD、NO、MDA含量结果 200 μg·mL-1狗脊多糖作用于1mM SNP造模后的软骨细胞，可通过上调SOD含量表达，同时下调NO、MDA含量表达。与空白对照组比较，模型对照组差异有统计学意义（P < 0.01），提示软骨细胞在一定程度上发生退变，软骨细胞退变模型建立；与模型对照组比较，各剂量狗脊多糖组差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），提示狗脊多糖可通过改善退变模型软骨细胞氧自由基表达来发挥抗氧化作用，进而在一定程度上延缓软骨细胞的凋亡进程。见表1和图3。

4 讨 论

4.1 狗脊多糖切合KOA的中医治疗病机 从中医辨证论治的角度看，KOA属“膝骨痹”范畴，其病机多为肝肾不足引起筋骨失养，外加风寒湿邪流注经络，困乏关节，致使气血运行受阻，引起关节活动受限，即其病位在“肝肾”，然病在“筋骨”，故对其治疗的根本法则为补益肝肾、祛风除湿，从而发挥固其根本以壮筋骨、通利关节之效。金毛狗脊Cibotium barometz（L.）J.S简称为狗脊，其作为临床治疗骨关节炎的常用中药材之一，入肝肾经，具有补肾柔肝、益盛筋骨、祛风除湿作用，故从中医角度，狗脊多糖切合骨关节炎本虚标实的病机[8-10]。

4.2 狗脊多糖干预KOA的机制 相关研究表明，关节内氧自由基含量的异常表达可通过介导氧化反应引起软骨细胞膜及胞内线粒体正常结构的破坏，这不仅影响细胞内能量生成，阻碍基质蛋白多糖与胶原的合成，同时也诱导细胞线粒体凋亡途径发生，最终引起细胞发生自溶[11-13]。其中，对氧化反应的转归影响较大的因素主要有以MDA和NO为代表的促氧化因子和以SOD为主的抗氧化因子[14]。本实验研究发现，狗脊多糖组与模型对照组比较，可显著降低软骨细胞液中MDA和NO的含量表达，并上调SOD的含量表达，其中尤其以200 μg·mL-1组效果显著，进而提示狗脊多糖干预KOA的作用机制为通过降低经硝普钠造模后软骨细胞中异常氧自由基含量表达，上调抗氧化因子水平，发挥抗氧化作用，这亦与前期研究结果相一致[7]，即经狗脊多糖最佳时效-量效的48 h与200 μg·mL-1干预软骨细胞后，可正向调控Cyclin D1、CDK4等蛋白与mRNA表达，其增殖机制为通过提高软骨细胞周期中G1至Gs的转变率未实现的。

综上所述，鉴于狗脊多糖在干预KOA方面发挥特殊疗效，故相关研究和科学工作仍需进一步开展。首先，对狗脊多糖中有效成分的进一步分离与纯化，及其在治疗KOA上的多通路、多靶点作用方面有待深入研究；其次，应进一步深入探究其对软骨细胞凋亡及相关炎性通路或指标的影响，以扩宽其干预骨关节的视角。总之，通过对狗脊多糖进行内涵与外延式的深入研究，逐步阐明其治疗机制，最终发挥狗脊多糖在治疗骨关节炎方面的多靶点、多功效的作用。

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