逆转素对肝星状细胞炎症反应的影响及机制

麦振豪，黄迪,2，翁杰锋,2，黄子圣，黄宇，张汉意，张帅,2，古维立,2

(1 广州医科大学附属广州市第一人民医院，广州510180；2华南理工大学第二附属医院)

肝纤维化是多种病因导致的一种慢性肝脏病理改变，炎症反应可促进肝纤维化的发生发展[1]。研究发现，肝星状细胞激活导致肝内细胞外基质沉积增加是肝纤维化发生的主要原因，而肝脏炎症的存在可以直接或间接刺激星状细胞活化，促进肝纤维化形成[2]。多种细胞因子如IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α、转录生长因子β(TGF-β)等均可诱导HSC活化[3]。逆转素(Reversine)是一种人工合成的小分子嘌呤衍生物，可使已分化的细胞重新具有多向分化的潜能[4]。本课题组前期研究证实，Reversine能促进HSC凋亡，并可抑制星状细胞中TGF-β1通路的激活[5]，但Reversine与肝脏炎症反应的关系尚未明确。2017年5～7月，本研究观察了Reversine干预对星状细胞TNF-α、核转录因子κB p65(RELA)、IL-6、IL-17A mRNA表达的影响。现分析结果，探讨Reversine在肝纤维化炎症反应过程中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝星状细胞购自广州中山大学细胞库；Reversine购自Sigma Aldrich公司； Recombinant Human TNF-α购自PeproTech公司；重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhTNFR，TNF-α抑制剂)购自三生国健药业(上海)股份有限公司。

1.2 细胞培养及分组处理 将肝星状细胞接种于含有100 mL/L FBS的DMEM培养基的35 mm培养皿内；置于5% CO2、37 ℃培养箱内进行传代培养。细胞生长至80%左右融合时进行传代并随机分为五组。对照组常规培养，低浓度Reversine组加入终浓度为5 μg/mL的Reversine培养，高浓度Reversine组加入终浓度为10 μg/mL的Reversine培养，TNF-α组加入终浓度为0.05 μg/mL的TNF-α培养，rhTNFR组加入终浓度为10 μg/mL的Reversine及终浓度为0.5 mg/mL的rhTNFR培养。各组均培养24 h。

1.3 细胞形态观察 各组于药物干预后在Olympus IX51倒置显微镜下观察细胞形态改变。

1.4 细胞TNF-α、RELA、IL-6、IL-17A mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。采用TRIzol法分别提取各组细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将总RNA转录为 cDNA，引物设计与合成均由广州市锐博生物科技有限公司完成。在PCR仪上进行实时定量PCR，测定靶基因的表达量。检测条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，61 ℃、30 s，70 ℃、30 s，40个循环。反应结束后，对所有样品进行规一化处理，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，以GAPDH作为内参基因。

2 结果

2.1 各组细胞形态变化 对照组细胞生长状态良好，贴壁牢，细胞间连接紧密，胞体呈梭形或形态不规则，具有树突状突起，边界清，大小均匀；Reversine组细胞间连接减少，出现皱缩、变圆、脱落，形成扁而大的细胞结构，上述细胞形态改变在高浓度Reversine组更明显；TNF-α组细胞亦出现皱缩、变圆等类似高浓度Reversine组的形态改变；rhTNFR组上述细胞形态改变程度小于Reversine组及TNF-α组。

2.2 各组细胞TNF-α、RELA、IL-6、IL-17A mRNA表达比较 见表1。

表1 各组细胞TNF-α、RELA、IL-6、IL-17A mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低浓度Reversine组比较，△P<0.05；与高浓度Reversine组比较，#P<0.05；与TNF-α组比较，▲P<0.05。

3 讨论

正常肝脏在一些致病因子的长期作用下会出现炎症反应，使肝细胞死亡，而肝细胞死亡又可以加重炎症反应程度，两者相互作用共同促进纤维化的发生。当致病因子消除或者人为干预后，肝纤维化可得到逆转，逆转的关键靶细胞是星状细胞[6]。Reversine是一种小分子药物，其分子结构式为C21H27N7O。Reversine可使定向细胞系去分化为未分化的具有多种潜能的干细胞，这些干细胞经诱导后可再次分化为不同种类细胞。Shan等[7]发现Reversine可通过抑制肌源性转录蛋白desmin和myogenin表达进而抑制星状细胞生长，还可促进Ezh2和PHC1蛋白表达使细胞重新编程。

TNF-α是目前公认的强大的促炎症细胞因子，主要由单核细胞谱系的细胞如巨噬细胞、星形胶质细胞等产生，通过介导1型和2型TNF受体发挥促炎作用，在多种慢性炎症疾病的发病中发挥关键作用[8]。有研究表明，TNF-α可通过c-Jun途径诱导促纤维化因子的表达，且可激活Kupffer细胞进而促进星状细胞活化，刺激星状细胞合成胶原，诱导纤维化形成；还可增强TGF-β对星状细胞的增殖和刺激胶原合成的作用[9]。本研究结果显示，Reversine组、TNF-α组、rhTNFR组干预后细胞形态均发生炎性改变，且高浓度Reversine组、TNF-α组更显著，提示Reversine可导致星状细胞发生炎症反应。

IL-6是一种主要由活化的单核细胞产生的多功能细胞因子，是肝脏炎症和急性反应阶段的重要炎症介质，可直接通过MAPK或JAK/STAT信号通路激活肝星状细胞[10]。Gajalakshmi等[11]发现，鼠肝脏来源的BMOL细胞分泌的IL-6可以通过NF-κB-iNOS-NO-ROS信号通路使活化的星状细胞凋亡，有潜在的预防肝纤维化发生的功能。亦有研究报道，IL-6虽然是重要的促炎因子，但在正常生理条件下是必不可少的，其通过选择性地介导信号通路抑制多种慢性肝脏病变的发生[12]。提示IL-6在肝纤维化炎症过程中发挥双重作用。

IL-17A的作用主要是介导炎症反应过程，亦可刺激α-SMA、TGF-β、TNF-α等表达，特别是对TGF-β/SMAD信号通路，IL-17A可上调TGF-β-RⅡ进而促进星状细胞活化，还可通过激活STAT3途径促进星状细胞形成Ⅰ型胶原，促进肝纤维形成[13,14]。Pu等[15]报道，IL-17A可激活ROS/p38通路进而促进内皮细胞组织因子表达，参与肝纤维化的炎症过程；IL-17A缺乏的肝纤维化小鼠其炎症及纤维化程度均减轻；提示IL-17A在促炎和促纤维化方面均发挥重要作用[16]。

RELA是Rel/NF-κB转录因子家族最常见的细胞转录因子，被认为是诱导促炎症基因表达的重要转录因子。RELA广泛存在于各种细胞中，可被各种刺激激活，与免疫应激、细胞增殖与凋亡、炎症反应等关系密切[17]。RELA不但可调节肝细胞、星状细胞等多种细胞的基本功能，也是炎症过程中各种炎性基因的关键调节因子，其激活可同时促进多种细胞因子如IL-1β、TGF-β1、TNF-α等表达。此外有研究发现，敲除RELA后星状细胞凋亡增加，Ⅰ型胶原形成减少，说明RELA可促进肝纤维化的发生发展[18]。

本研究结果显示，肝星状细胞经高浓度Reversine处理后TNF-α mRNA表达减少、 IL-6 mRNA表达增加；Reversine抑制TNF-α表达的效果弱于rhTNFR，提示Reversine可能不是通过TNF-α途径发挥作用，其可能通过作用于IL-6发挥作用。TNF-α明显刺激IL-17A mRNA表达，高浓度Reversine处理后IL-17A mRNA表达明显受到抑制，且其抑制效果比rhTNFR更强。Reversine抑制IL-17A表达的能力强于rhTNFR。Reversine有可能通过抑制星状细胞 IL-17A表达发挥抗炎、抗纤维化作用。本研究中各Reversine干预组RELA mRNA表达无明显变化，提示Reversine对RELA的调节作用不明显。IL-6表达增加可通过NF-κB-iNOS-NO-ROS通路促进星状细胞凋亡。但本研究各组干预前后RELA表达无明显变化，说明Reversine不能刺激NF-κB表达，其通过IL-6途径促进星状细胞凋亡的可能性不大，但由于IL-6是炎症反应中的关键因子，所以Reversine更有可能是通过直接促进IL-6表达进而参与调节其他炎症因子的表达而发挥作用，但其具体机制仍需进一步探讨。Reversine抑制IL-17A的表达，可能是通过抑制肝星状细胞激活发挥作用，还可进一步抑制α-SMA、TGF-β等促纤维化蛋白表达，使胶原纤维沉积减少。

综上所述，Reversine可抑制肝星状细胞的炎症反应；抑制IL-17A表达、促进IL-6表达可能是其作用机制。