一种简易的细胞烟草烟雾暴露装置的构建

李梦鸽，毛建文

吸烟或二手烟是慢性支气管炎、肺气肿和慢性气道阻塞的主要诱因之一。吸烟可引起中央性及外周性气道、肺泡及毛细血管结构及功能发生改变，同时对肺的免疫系统产生影响，从而导致肺部疾病的产生。在研究吸烟与肺部疾病的关系中，有体内实验和体外实验两种方式：体内实验主要为动物模型，体外实验主要为细胞模型。在体外实验中，人肺细胞可以接受适当剂量烟草烟雾的处理，用来研究烟草烟雾对细胞的影响并探讨其机制。经典的体外模型是将烟草提取物加入细胞培养基作用于细胞即浸没式细胞培养方法。已有大量的研究利用这种方法研究烟草对多种气道细胞和呼吸系统的影响及机理[1-7]。然而，浸没条件下的烟草烟雾暴露并不能真实地反映出吸烟者吸烟或吸入二手烟时体内细胞发生的暴露条件。为了尽可能接近气道或肺细胞在空气-液体界面暴露于烟草烟雾的情况，一些公司和研发机构近些年研发出新型全烟雾曝露体外细胞培养系统，此类系统以产生烟草烟雾并将全烟烟雾输送到体外细胞培养系统的毒理学和生物学评估，包括Cultex公司的香烟烟雾细胞暴露系统、英美烟草曝露室（British American Tobacco’s(BAT)exposure chamber）[8-9]和 Borgwaldt RM20S 吸烟机[10-11]。 这些仪器具有全自动定量产生香烟烟雾，高通量等特点，但此类仪器价格昂贵，不便于探索性研究。为了满足小型实验室研究所需，根据该类仪器的原理，该次在2017年3月份构建了一个简易版的细胞烟草烟雾暴露室，并通过检测烟草烟雾暴露对气管上皮细胞自噬的影响验证了其可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

HBE细胞来自广州中医药大学惠赠；高糖DMEM、FBS胎牛血清购自Gibico公司；LC3B抗体、GAPDH抗体、DAPI染色液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术公司；transwell小室购自Corning公司；Dylight 488 Conjugated Rabbit Anti-Goat IgG(H+L)购自 Abbkine 公司；固定液、免疫染色封闭液、抗荧光淬灭剂购自碧云天生物技术公司，磷酸盐缓冲液（PBS）购自博士德生物工程有限公司，双圈定性滤纸购自杭州沃华滤纸有限公司,脱脂奶粉、注射器购自广州翔博生物技术有限公司。

1.2 细胞免疫荧光

与烟草烟雾作用后的细胞吸弃培养基，用PBS洗3次后，加固定液固定15 min后，吸除，用PBS洗3次，加免疫染色封闭液封闭1 h，吸除后加入 LC3B抗体（1∶100），4℃孵育过夜。吸除抗体后，PBS洗3次，加入荧光二抗，孵育1 h，吸除后 PBS洗 3次，加入DAPI，3 min后吸除，PBS洗3次，加入抗荧光淬灭剂后封片。随后置于ZEISS荧光显微镜下观察并采集图像。

1.3 蛋白质免疫印迹

蛋白质免疫印迹法检测自噬相关蛋白的变化，提取与烟草烟雾作用后细胞的总蛋白，用BCA法测得蛋白样品的浓度，计算蛋白上样量，SDS-PAGE电泳后转膜，转膜后，TBS/T洗3次，用奶粉室温封闭2 h，TBS/T洗3次后加入一抗（LC3B，1∶1 000；GAPDH，1∶1000)，4℃孵育过夜。 吸除一抗后，TBS/T洗3次，加入相对应的二抗，室温孵育1 h。TBS/T洗3次后，显影、定影。蛋白质免疫印迹结果使用Image J进行灰度分析。

1.4 统计方法

使用SPSS 22.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用 t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义，采用Graphpad Prism5软件进行作图。

2 结果

2.1 烟草烟雾暴露装置的构建及暴露方法

利用transwell小室的半透膜来达到承接的目的，使细胞在接触培养基保持生存状态的同时，又能暴露在烟草烟雾中，与烟草烟雾相互作用。细胞烟草烟雾暴露装置如图1所示;在一个干净的容器底部放置浸满培养基的滤纸，把有细胞生长的transwell小室放在滤纸上以保持细胞生长在一个湿润的环境中，用注射器吸取烟草烟雾之后注入transwell小室中，使得细胞能够充分接触烟草烟雾，烟草烟雾暴露装置和暴露过程是在通风橱中进行的，为便于烟雾吸出。

①种板：两个transwell小室，每个小室种50万个HBE细胞，细胞第2天备用，其中一个为实验组，一个为正常对照组。②将泡过酒精的注射器、管子、放置transwell小室的容器照紫外杀菌。③在容器底部放两层浸满培养基的滤纸，按照图1所示放入transwell小室。④用注射器吸取烟草烟雾通过管子注入transwell小室中。⑤烟草烟雾与细胞的作用时间为30 min[10]。⑥作用结束后，用PBS洗涤3次后，放入37℃的培养箱中继续培养24 h。

图1 细胞烟草烟雾暴露装置示意图

2.2 烟草烟雾暴露致HBE细胞自噬体增加

自噬体是从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分所形成的。LC3蛋白首先会在合成后立即在其羧基端被Atg4(酵母蛋白)所剪切，产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7(酵母蛋白)和Atg3(酵母蛋白)在内的泛素样体系所修饰和加工，并定位到自噬小体中。这样，自噬小体中存在的LC3，和低分子量的LC3-II都被当做细胞发生自噬的分子标志，LC3B作为LC3的一种，可以用作自噬的分子标志。由图2结果显示：烟草烟雾组的自噬体数量较多且自噬体比较聚集，而正常对照组的自噬体几乎没有且较弥散。烟草烟雾组和正常对照组相比，自噬体明显增多。

图2 烟草烟雾暴露对LC3B表达分布的影响

2.3 烟草烟雾暴露致HBE细胞LC3BII/LC3BI比值上升

LC3是自噬标志物，自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为自噬体膜型（即LC3-II），LC3-II/I比值的大小可评估自噬水平的高低。LC3B作为LC3的一种，可以用作自噬的分子标志，LC3BII和LC3BI的比值作为自噬强弱的指标，比值越大，表示自噬越强。图3结果显示：烟草烟雾组的LC3BII/LC3BI的比值明显大于正常对照组提示烟草烟雾暴露促进了HBE细胞的自噬。

图3 .烟草烟雾暴露对LC3B蛋白表达的影响

3 讨论

长期吸烟或二手烟可引起各种肺部炎症和肺纤维化，直至诱发肺癌。肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，因此烟草烟雾暴露与肺部疾病关系的研究一直是研究重点。一直以来，将烟草提取物加入培养基的浸没式培养法是研究烟草对气道和肺细胞作用的主要方法，但该方法的缺点是作用条件与体内条件差异较大。近年基于空气-液体界面原理，装配有全自动吸烟装置的香烟烟雾细胞暴露系统被开发出来，这些暴露系统和传统的浸没式暴露方法相比具有更大的生理意义，在空气-液体界面下培养的细胞培养物并使细胞暴露于两相的同时接受烟草烟雾的作用，来捕获两者之间的相互作用。但该系统价格昂贵，不适合小型实验室或探索性研究用。该研究基于该系统的原理，利用transwell小室、六孔板、注射器、滤纸和硅胶管等成功构建了简易的细胞烟草烟雾暴露装置。该装置材料来源容易，价格低廉，构建方法简单，适合小型实验室及探索性研究烟草烟雾暴露对气道或肺细胞影响的研究。

细胞内的物质主要有两种降解途径，一种是通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。正常生理条件下，细胞内保持一个低的基础自噬水平，但是当细胞在营养能量缺乏、氧化应激、感染等情况下，自噬水平会迅速被上调[12]。自噬提供了细胞维持体内平衡和适应不利环境的基本功能[13-15]。LC3在自噬前体和自噬体的膜上特异性表达，由于可被酸性水解酶降解，LC3在自噬溶酶体存在较少。在哺乳动物细胞内LC3B的总量不会有较大的波动，在自噬增加时会出现LC3B-I向LC3B-II进行转换。一些学者的研究证明，烟草烟雾可以诱导细胞发生自噬[16-17]。该研究利用构建的简易烟草烟雾暴露装置，将HBE细胞置于烟草烟雾暴露后，利用细胞免疫荧光和蛋白质免疫印迹法分别检测LC3B的表达分布及LC3BII/LC3BI比值的变化，观察烟草烟雾暴露对HBE细胞自噬的影响，结果显示烟草烟雾明显促进HBE细胞的自噬，说明设计的简易版烟草烟雾暴露室可以用于烟草烟雾与细胞作用及其机理探索的研究。

综上所述，该研究利用简单易得的材料设计了简易的烟草烟雾暴露装置，该装置可以用于烟草烟雾暴露对与气道或肺细胞影响和机理的研究，且该装置具有材料简单，制作简易、价格低廉等优点。