抑郁症大鼠海马组织中硒元素结合蛋白1的表达及意义

赵 海1，宋继文2，乔小东

(1.山西工人晋祠疗养院，山西 太原 030025；2.山西省肿瘤医院，山西 太原 030013；3.太原市中心医院，山西 太原 030006)

抑郁症是较为常见的心理障碍之一，随着生活节奏的加快以及社会竞争的日益激烈，抑郁症在全世界范围内的发病率呈逐年增高的趋势[1]。硒(Se)是一种微量元素，但在机体内发挥着非常重要的作用，是抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成成分，Se在抗氧化、抗衰老、免疫调节等方面发挥重要的作用，有研究表明：硒元素的摄入不足与抑郁症的发生有一定的关系，含硒化合物可减少抑郁症小鼠的氧化应激和神经系统炎症反应[2]。硒在体内主要以化合物的形式发挥作用，硒元素结合蛋白1(Selenium binding protein1，SBP1)是Se元素在体内发挥生物活性的重要媒介及结合蛋白，在精神分裂、抑郁障碍等疾病中，SBP-1基因拷贝数发生变异，脑组织中SBP-1的表达失调，提示其可能参与了身心疾病的病理过程[3]。本研究观察了抑郁症大鼠模型海马组织中Se元素的含量及SBP-1蛋白的相对表达量，初步探讨两者与抑郁症的相关性，现将结果整理报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级wistar大鼠购自山西医科大学实验动物中心，出生6周龄，雌、雄各20只，随机分为两组(模型组及对照组)，每组雌、雄各半。饲养条件：大鼠专用饲料及纯净水单笼饲养，温度22℃，相对湿度50%，对照组大鼠光线12 h明暗交替。

1.2 试剂及主要仪器

Se元素标准溶液(浓度：1 000 μg/mL，国家标准物质研究中心)；SBP-1一抗(Abcam：ab91035)；内参GAPDH(美国santa-cruz：SC293335)；BCA蛋白浓度检测试剂盒(武汉博士德)；全自动元素分析仪(美国海洋)；石墨炉原子吸收光谱仪(上海元析)；分光光度仪(日本Bio-rad)；电泳仪(北京六一)；转膜仪(日本Bio-rad)；凝胶成像仪(上海天能)。

1.3 大鼠抑郁模型的建立及判定方法

模型组采用慢性不可预见性的应激(chronic unpredicted mild stress, CUMS)方法建立抑郁症模型，具体方法参考文献[4]。刺激内容包括禁食禁饮、电刺激、夹尾、悬吊、昼夜颠倒。每日给予一种刺激，每种刺激累计使用2～3次，顺序随机，使动物不能预料刺激的发生，持续6周。采用糖水偏好实验和空场实验(open field test，OFT)评价抑郁症大鼠动物模型：a)糖水偏好实验：每笼同时给予1%蔗糖水及纯净水各1份，1 h后计算蔗糖水消耗量。b)OFT实验：将大鼠单独置于长100cm，宽100 cm，高50 cm的空场箱，底面划分为25个等边方格，计算机记录大鼠5 min内水平穿格、垂直穿格次数及逃避潜伏时间。

1.4 血清硒元素含量的测定

实验6周时，取大鼠尾静脉血1 mL，室温静置10 min，5 000转离心10 min，取上清液，全自动元素分析仪检测硒元素含量。

1.5 海马组织硒元素含量的测定

造模6周后，断头处死大鼠，开颅后迅速取出海马组织，电子天平称取海马组织25 mg(湿重)，烘箱将组织烘干，其余迅速置于低温冰箱中用于western-blot实验。将组织置于硝酸与高氯酸体积比为4∶1的消化液中充分混匀，去离子水定容至10 mL。采用Se元素标准溶液稀释，分光光度计检测吸光度值，Se元素工作曲线为Y=0.047 5X+0.021 7 (r=0.999 7)，采用石墨炉原子吸收光谱仪进行元素含量检测。

1.6 海马组织中SBP-1的表达量的测定

电子天平称取海马组织25 mg，加入组织裂解液，冰上匀浆至稀糊状，4℃离心机，12 000转离心5 min，吸取上清液，BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%SDS，分离胶浓度10%)，电压100 v电泳45 min。将凝胶蛋白转膜至硝酸纤维素膜，电压100 v，转膜35 min。一抗4℃过夜反应(SBP-1浓度1∶300，GAPDH浓度1∶500)，二抗室温反应1 h(浓度均为1∶5 000)。电化学发光液反应，凝胶成像仪曝光显色。Bandscan软件分析条带灰度值，SBP-1表达量=SBP-1灰度值/GAPDH灰度值。

1.7 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析，两计量资料的比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 对照组及模型组行为评价及糖水偏好比较

与对照组相比，模型组大鼠的逃避潜伏时间延长，水平运动及垂直运动的评分降低；与对照组相比，模型组大鼠的糖水消耗降低；差异均有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明慢性不可预见性应激诱导的抑郁症大鼠模型建立成功。见表1。

2.2 大鼠血清及海马组织中Se元素含量比较

对照组、模型组血清Se元素的含量依次为(0.19±0.04)μg/mL，(0.18±0.06)μg/mL，两者相比差异无统计学意义(t=0.42，=0.68)；对照组、模型组海马组织中Se元素的含量依次为(0.09±0.02)μg/mL，(0.08±0.02)μg/mL，两者相比差异无统计学意义(t=0.88，P=0.22)。

2.3 大鼠海马组织中SBP-1蛋白的表达

SBP-1在蛋白分子量52KD处出现显影条带，内参蛋白GAPDH在36KD处出现显影条带，与对照组相比，模型组大鼠海马组织SBP-1蛋白的相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表2。

表1 慢性不可预见应激对wistar大鼠行为和糖水消耗的影响

图1 对照组及模型组中SBP-1蛋白的表达(western-blot：C为对照组，M为模型组)

表2 大鼠海马组织中SBP-1蛋白的相对表达量

组别SBP-1/GAPDHt值P值对照组0.44±0.08模型组0.15±0.065.910.00

3 讨论

有关Se与抑郁症的研究报道显示，外源性提高Se的摄入量可降低抑郁症的发生，成人血清Se的浓度与抑郁症状及负面情绪密切相关[5]。SBP-1是Se在机体内重要的结合蛋白，在免疫调节、抑制肿瘤细胞增殖等方面发挥着重要的作用，有研究提示Se与SBP-1可能与身心疾病的发生发展密切相关[6,7]。

本研究采用慢性不可预见性应激诱导大鼠抑郁症模型，结果显示，实验6周时，模型组大鼠的糖水摄取较对照组降低，OFT实验逃避潜伏期延长、运动评分下降，说明抑郁症模型构建成功。大多数微量元素均在血清中以离子状态和结合蛋白形式存在，血清学检测是检测微量元素病理性蓄积或减少的常用方法，本研究结果表明：模型组及对照组大鼠血清Se元素的含量无显著差异。海马是大脑负责记忆、学习等功能的重要区域，海马区损伤、神经传导异常、受体结合失调及应激性损害与身心疾病，尤其是抑郁症的发生密切相关[8]，本研究原子吸收光谱实验结果显示海马组织中对照组和模型组Se元素的含量也无差异，但western-blot结果表明模型组海马组织中SBP-1蛋白较对照组下降，上述结果表明，在慢性不可预见应激诱导的大鼠抑郁模型中外周血及海马组织中Se元素的绝对含量并无明显降低， Se在抑郁大鼠海马组织中可能是由于结合蛋白的下调而导致其利用受限。

综上所述，本研究在抑郁动物模型中分析了Se及其结合蛋白SBP-1的表达模式，SBP-1的下调可能参与了抑郁症的病理过程。值得注意的是，动物模型个体间差异较小，而人个体间差异较大，Se及SBP-1在人类抑郁症中的作用可能与动物模型有所不同，并且Se的代谢途径及结合蛋白多种多样，其发挥作用的具体功能尚待进一步研究。