γ-干扰素体外释放试验对活动性肺结核的诊断价值

闵少菊，刘　念，谭玉洁

近年来，随着人口大规模流动及多重耐药结核菌菌株的出现，肺结核疫情呈上升趋势［1－3］。 传统检测方法如PPD试验，受卡介苗接种影响导致检测结果假阳性率偏高，痰涂片阳性检出率较低，难以满足临床诊疗的需要，如何快速、准确诊断肺结核已成为临床医师和检验医师重点关注和亟待解决的问题。以T细胞免疫为基础的TB－IGRA试验在结核分枝杆菌感染检测中应用较广［4，5］。 TB－IGRA 是利用在大部分的非结核分枝杆菌以及所有的牛型分枝杆菌（包括卡介苗）中均不存在，而在结核分枝杆菌中存在的菌种特异性抗原，体外刺激活化T淋巴细胞产生 IFN－γ的原理而建立［6］。因此，TBIGRA特异性比PPD高得多，使其在临床得到广泛应用［7］。该研究通过TB－IGRA试验测定活动性肺结核组、非活动性肺结核的呼吸疾病组和健康对照组特异性IFN－γ水平，绘制ROC曲线，探讨TBIGRA对活动性肺结核的诊断和鉴别诊断价值，并与结核杆菌抗体和痰涂片抗酸染色方法进行比较，分析TB－IGRA对活动性肺结核的临床诊断价值。

1　资料与方法

1.1标本来源选取笔者所在医院2016年1—12月进行TB－IGRA试验住院患者280例。分为活动性肺结核组120例，其中男72例，女48例；平均年龄（44．30±19．18）岁。 非活动性肺结核的呼吸疾病组160 例，男 95 例，女 65 例；平均年龄（58．24±17．49）岁。47名健康对照组为该院同期健康体检者，男21名，女 26 名；平均年龄（50．51±10．16）岁。 活动性肺结核组根据我国2008年修订的 《结核病的诊断标准和分类》确诊分类，非活动性肺结核的呼吸疾病组标本来源于同期入院的结核菌涂片阴性的肺部疾病住院患者。健康对照组由本院体检X线胸片无异常，无结核病临床症状，同时排除心、肝、肺、肾等疾病的健康人群。

1.2仪器与试剂结核菌染色液（珠海贝索生物有限公司）、人结核杆菌IgG抗体检测（胶体金法）试剂盒（北京贝尔）及结核感染T细胞检测试剂盒（北京万泰）。ST－360酶标仪和洗板机 （上海科华）、BSC1500ⅡB2－X生物安全柜（济南鑫贝西）、电热恒温培养箱和电热恒温水浴箱等。

1.3试验方法

1.3.1结核分枝杆菌γ－干扰素体外释放试验（TBIGRA）使用BD生产肝素抗凝的真空采血管采集全血至少4 ml；将标本轻柔颠倒混匀后分装到阴性对照、测试及阳性对照培养管中，1 ml/管；颠倒混匀后立即放入37℃培养（22±2）h。将培养管3000转/min离心10 min，取血清用ELISA法检测IFN－γ含量。应用北京万泰公司提供的自动计算软件，输入校准品浓度和校准品OD值绘制相应曲线，要求每次实验所得曲线的相关系数R2＞0．99，在软件中输入样本OD值后计算IFN－γ含量，并由软件自动判定阴阳性结果。

1.3.2结核杆菌抗体（TB－Ab）实验方法将待检测标本 （检测TB－IGRA后肝素抗凝管内全血3000转/min离心10 min后分离出的血清）100μl加到检测孔中，15～20 min内观察结果。

1.3.3痰涂片抗酸染色法嘱患者清晨用清水漱口后咳出肺深部的痰液，痰量不少于3 ml，置于专用有盖痰盒内，专人及时送检。在生物安全柜中制备痰涂片并于紫外灯下照射1 h待其自然干燥；5%苯酚复红初染、3%酸性乙醇脱色和亚甲基蓝溶液复染。先用低倍镜观察全片，再用高倍镜镜检，至少观察300个高倍镜视野。

1.4统计学分析实验数据用SPSS 19．0软件处理，计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验，以α＝0．05为显著性检验水准。绘制ROC曲线，以Youden指数最大时的IFN－γ含量为最佳临界值，并计算其灵敏度和特异性。

2　结果

2.1各组IFN-γ水平比较活动性肺结核组IFN－γ 水平［（156．86±128．19） pg/ml］，明显高于健康对照组［（22．15±71．52） pg/ml］和非活动性肺结核的呼吸疾病组［（55．31±103．39） pg/ml］，差异均有统计学意义（t＝－8．593，t＝－7．115，均为 P＜0．05）；非活动性肺结核的呼吸疾病组IFN－γ水平高于健康对照组，以α＝0．05为显著性检验水准，差异有统计学意义（t＝2．502，P＜0．05）。

2.2三种检测方法结果阳性率比较TB－IGRA在活动性肺结核组阳性率显著高于非活动性肺结核的呼吸疾病组和健康对照组，且差异均有统计学意义（P＜0．05）。在活动性肺结核组中，三种方法的阳性检出率以 TB－IGRA最高，为 88．33%，且与结核抗体和痰涂片抗酸染色结果比较，差异有统计学意义（P<0.05）。 见表 1。

2.33种不同检测方法对活动性肺结核的诊断效能评价TB-IGRA的灵敏度和阴性预测值分别为88.33%和90.79%，均高于其他两种方法，而特异度及阳性预测值均低于其他两种方法。见表2。

2.4绘制ROC曲线以活动性肺结核组为阳性组，健康对照组和非活动性肺结核的呼吸疾病组为阴性组绘制ROC曲线A；以活动性肺结核组为阳性组，健康对照组为阴性组曲线B。两条曲线的灵敏度相同，但是曲线B的特异度明显高于曲线A，这是因为剔除了非活动性肺结核的呼吸疾病组作为阴性对照结果后，大大提高了TB-IGRA检测的特异度。见表3。

表 1　3种检测方法阳性率分析

表 2　3种检测方法的评价

表 3　不同ROC曲线的比较

3　讨论

TB-IGRA是利用人体感染结核分枝杆菌后，体内致敏T淋巴细胞再次受到相同抗原刺激后，可迅速产生大量IFN-γ，检测IFN-γ含量可间接反映体内结核分枝杆菌感染情况［8-10］。该方法与传统结核杆菌感染诊断方法比较具有快速、简便及利于批量检测等优点，且选用的CFP10/ESAT6特异性蛋白可有效避免卡介苗接种后的假阳性结果。

该研究结果表明，活动性肺结核组IFN-γ水平均明显高于非活动性肺结核的呼吸疾病组和健康对照组（P<0.05），说明人体感染结核分枝杆菌并发展为活动性肺结核后，血浆的IFN-γ水平明显升高［11，12］，提示动态监测 IFN-γ 水平逐渐升高时，诊断为活动性肺结核的可能越大。TB-IGRA目前不能用于区分活动性肺结核、潜伏性结核感染和陈旧性结核［13］，而我国结核分枝杆菌感染率较高，故非活动性肺结核的呼吸疾病组和健康对照组IFN-γ水平升高，与被检者可能存在陈旧性肺结核或与结核分枝杆菌潜伏感染有关，但高水平的IFN-γ含量可作为活动性肺结核重要的辅助诊断依据。

活动性肺结核组三种检测方法阳性检出率均显著高于非活动性肺结核的呼吸疾病组患者和健康对照组（P<0.05），说明结核分枝杆菌在机体内处于活动期时，机体的免疫系统受到抗原刺激后无论是细胞免疫还是体液免疫均产生应答，因此三种方法对结核感染的诊断均有一定的参考价值［14］。但活动性肺结核组TB-IGRA的阳性率明显高于结核杆菌抗体实验和痰涂片抗酸染色法，且灵敏度最高，但其特异性均低于其他两种方法，TB-IGRA、结核抗体和痰涂片抗酸染色法准确度分别为74.62%、69.72%、75.84%，表明TB-IGRA检测具有较高的准确度。说明该方法对于活动性肺结核早期筛查具有一定临床价值。由于我国人群结核分枝杆菌感染率偏高，潜伏感染可能性大，使得TB-IGRA检测的特异度有所降低。统计显示TB-IGRA对活动性肺结核组阳性预测值为60.57%，低于其他两种方法；其阴性预测值最高为90.79%，提示TB-IGRA检测的阴性结果对活动性肺结核的排除诊断具有重要作用［15］。

ROC曲线分析TB-IGRA应用于活动性肺结核特异性诊断的曲线下面积为0.898，有较高的辅助诊断价值，本研究结果显示当IFN-γ临界值被设定为19.11 pg/ml时，其对活动性肺结核病的辅助诊断具有较高的灵敏度（86.70%）和特异度（87.20%），可用于活动性肺结核组和健康人群的鉴别诊断。在以不同人群为阴性对照组绘制ROC曲线时，具有不同的特异度和诊断效能，主要是结核分枝杆菌潜伏感染的诊断缺乏“金标准”，而非活动性肺结核的呼吸疾病组中可能存在未诊断明确的肺结核患者，造成诊断特异度的差异。

TB-IGRA对活动性肺结核具有较高的临床诊断价值，且血浆IFN-γ的含量较高时，对辅助诊断活动性肺结核的临床意义较大。同时，其阴性结果对排除活动性肺结核也有重要价值。