N-（4-羟基苯基）维生素甲酰胺对肺癌H1299细胞增殖的影响

张 玲，周 青，汪 渊

肺癌在我国发病率高，病死率高.因早期无明显症状，就诊时往往已是中晚期，治疗难度大，因此亟需开发肺癌敏感的药物来抑制肿瘤细胞的恶性增殖，控制疾病的发展进程.N-（4-羟基苯基）维生素甲酰胺（4-HPR）是全反式维甲酸（ATRA）的衍生物，在国外乳腺癌、前列腺癌等研究中已进入了临床试验阶段［1-2］，是一种强有力的化疗药物.肺癌的病理类型多，已发现的肺癌细胞株亦较多.

本课题组的前期研究中发现4-HPR显著抑制肺癌A549的增殖［3］.本实验旨在观察4-HPR对肺癌H1299细胞增殖的影响，为其用于临床肺癌治疗提供一定的理论和实验依据.

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

主要试剂：DMEM培养基（美国Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司），胰酶、BCA试剂盒（Beyotime公司），细胞用DMSO（Appli⁃chem公司），CCK-8（南京建成生物公司），结晶紫染料（上海生工生物工程公司），4-HPR（MCE公司），ATRA（DC Chemicals公司），兔源抗人p-p38抗体（CST公司），兔源抗人p38、鼠源抗人β-actin抗体（santa cruz公司），兔来源抗鼠、羊来源抗兔IgG抗体（millipore公司），ECL试剂盒（Thermo fisher公司）.

主要仪器：细胞培养箱（Thermo fisher公司），超净台（苏州净化设备有限公司），倒置显微镜（奥林巴斯有限公司），化学发光成像仪（上海勤翔仪器公司）.

1.2 细胞培养

将H1299细胞株培养于25cm2培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置37℃，5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养.细胞长至80%～90%密度时用胰酶消化传代，取处于对数生长期的细胞接种于孔板中，进行后续实验.

1.3 细胞增殖实验

按4000个/孔细胞种入96孔培养板，过夜培养，贴壁后加药处理.设置细胞对照组、溶剂对照组、1μmol 4-HPR组、5μmol 4-HPR组、10μmol 4-HPR组和50μmol 4-HPR组，每组设6个复孔，培养48h.加入CCK-8试剂，2h后用酶标仪测吸光度.根据各处理组吸光度（OD）值，计算药物对细胞增殖的抑制率：（细胞对照组OD值-各处理组OD）/细胞对照组OD值×100%，绘制抑制率对药物浓度的柱状图，分析4-HPR对细胞增殖的影响.

1.4 倒置显微镜下观察

实验分细胞对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、10μmol/L 4-HPR组，共三组.待细胞长至40%～50%密度时加药处理，48h后倒置显微镜下观察，并拍照记录.

1.5 平板克隆实验

实验分组同1.4，待细胞处于对数生长期，加药处理48h，胰酶消化，分别收集各组细胞，吹打为单个细胞悬液，计数各孔细胞，稀释至相同密度，并把细胞悬浮在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，分别接种于六孔板各孔.培养箱中培养8～10天左右.弃去上清液，用PBS浸洗，加4%多聚甲醛固定.弃去后加1%结晶紫染色，然后用流水洗去染色液，倒置，空气干燥.拍照记录.在低倍镜下计数大于50个细胞集落作为克隆数.最后计算克隆形成率：（克隆数/接种细胞数）×100%.

1.6 Western blot

收集药物处理的细胞，分组同实验1.4，加入RIPA缓冲液（Tris-HCl，pH 7.4；150mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，1%Triton，0.1%SDS，磷酸酶抑制剂）提取蛋白，BCA法蛋白定量.取50μg/孔蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜上.5%脱脂奶粉封闭2h，加鼠源抗人、兔源抗人抗体4℃孵育过夜，TBST洗涤后再加入相应浓度的兔来源抗鼠、羊来源抗兔IgG抗体室温孵育2h，洗涤后用ECL试剂盒检测，机器显影，采用Image Pro Plus软件进行灰度扫描，分析各条带的灰度值，以p-p38/p38进行比值计算作半定量分析.

1.7 统计学处理

实验重复3次，取其均值.采用SPSS 10.0统计软件进行分析，数据以-x±s表示，各组间数据比较采用单因素方差分析.P＜0.05有统计学意义.

2 结果

2.1 梯度药物对H1299细胞增殖的影响

如图1结果所示，药物作用48h，与细胞对照组比较，随着4-HPR浓度增大，细胞增殖抑制率逐渐增大（P＜0.05）.25μmol/L抑制率已接近80%.选取10μmol/L药物浓度进行后续实验研究.溶剂对照组与细胞对照组比较无明显抑制作用.

图1 梯度药物对细胞增殖抑制率与细胞对照组比较：＊P＜0.05

2.2 不同处理组H1299细胞生长变化

药物处理48h，显微镜下可见细胞对照组、溶剂对照组细胞密度大，光泽度好（如图2A、2B）.4-HPR组细胞数明显减少，失去正常生长，细胞生长面之上漂浮有圆形死细胞（如图2C）.

图2 不同处理对细胞生长的影响×100

2.3 不同处理组H1299细胞增殖能力变化

平板克隆实验结果表明，药物作用48h后，细胞和溶剂对照组形成细胞集落能力强，细胞克隆密集，单个克隆体积大，两组间克隆形成率没有明显差异（如图3A、3B）.4-HPR组细胞克隆稀疏，单个克隆体积小，克隆形成率明显降低（P＜0.05）（如图3C）.

图3 药物处理细胞增殖能力的变化分组同图2，与细胞对照组比较：＊P＜0.05

2.4 不同处理组H1299细胞蛋白表达变化

Western Blot结果分析表明，4-HPR组可明显增加p38的磷酸化（p-p38）水平，细胞对照组与溶剂对照组中p-p38表达无明显差异（P＜0.05）（如图4所示）.

图4 药物处理细胞p-p38表达水平变化与细胞对照组比较：＊P＜0.05

3 讨论

肺癌是目前发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一.全国肿瘤防治办资料显示，我国肺癌发病率年增长率为26.9%，若不采取控制措施，到2025年，肺癌患者将达到100万，我国将成为世界第一肺癌大国［4］.ATRA是维生素A的主要活性代谢物，作为维甲酸类药物的代表，已被用于治疗急性早幼粒细胞性白血病［5］.然而ATRA使用会产生维甲酸综合症，并且长期使用会发生维甲酸抵抗，限制其在肿瘤治疗中的应用［6］.4-HPR是ATRA众多衍生物中对肿瘤抑制作用较强的合成物.在本研究中发现，4-HPR可显著抑制人肺癌H1299细胞的增殖，10μmol/L的药物浓度细胞增殖抑制率已接近30%.国外将4-HPR用于儿童神经母细胞瘤的临床治疗，监测血药浓度发现，患儿血液中药物浓度可以达到12.9μmol/L［7］.结合本研究中 4-HPR抑制肺癌细胞增殖的有效浓度，显示将4-HPR用于肺癌的临床治疗是有前景的.

细胞增殖是以细胞分裂方式增加细胞数量的过程，是细胞生命活动的重要特征之一.当正常细胞在多种因素的影响下，周期调节失控，获得自主生长信号，导致细胞无限增殖，就会产生肿瘤［8］.增殖不受控制是肿瘤细胞的最基本特性之一.肺癌的发生发展也是肺癌细胞无限增殖的结果.因此，本研究主要从细胞增殖方面，研究了4-HPR对肺癌H1299细胞株的作用.4-HPR作用后，镜下可见H1299细胞明显减少，肺癌细胞的克隆形成能力亦明显降低.

细胞增殖失控过程中，多种蛋白及相关因子起了重要作用.通过对肿瘤细胞增殖相关的蛋白检测，可以了解肿瘤细胞的增殖情况，再结合临床检查，可对肿瘤的早期诊断和预后评估提供帮助.同时，随着分子生物学和基因工程技术的发展，以相关蛋白作为攻击靶点，已研制出了一些抑制肿瘤细胞增殖的药物，但针对某种特异性基因或蛋白的药物仍然缺乏，需要继续探索.丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族是细胞内的主要信息传递系统，p38是MAPK家族成员之一，磷酸化后激活.大量研究证实，p38的活化水平对多种肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移等均有调控作用［9-13］.亚硒酸钠抑制肺癌细胞A549增殖并促进p38磷酸化［14］，索拉菲尼抑制人口腔癌细胞增殖与p38的活化相关［15］，五味子乙素抑制结肠癌SW480细胞增殖和侵袭的同时p-p38蛋白水平明显增加［16］.

本研究发现，4-HPR抑制细胞增殖过程中伴随p38磷酸化水平的增加，与相关研究吻合.然而国外有研究报道，药物抑制肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学行为伴随着p38的失活［17］.早前即有研究认为，MAPK家族在人不同组织肿瘤中的作用机制不同，因此所起的作用不同，甚至细胞周期的分期不同，这些酶的作用也不同［18］.故进一步探讨p38信号通路在4-HPR抑制肺癌细胞增殖中的作用，对指导肺癌的防治具有重要价值.