超声辅助高速均质制备人乳脂类似物乳液工艺优化

杨溶，覃小丽，杨贵妃，钟金锋，刘雄

(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)

传统婴幼儿配方乳液中的油脂配料(植物油和牛乳脂)虽与人乳脂在脂肪酸组成上接近，但在甘油酯结构上仍存在较大差异，这种差异易造成脂肪酸(能量)和钙的双重损失[1-2]。近十年来，利用酶法催化动植物油获得富含1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯(1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol，OPO)的人乳脂类似物(或人乳脂替代品)是婴幼儿配方乳液研究的热点之一[3-5]。相比传统婴幼儿配方乳液中油脂配料，人乳脂类似物富含OPO，使脂肪酸易于吸收，能减少不溶性钙皂并改善肠道健康[6-8]。目前，以人乳脂类似物作为新一代婴幼儿配方乳液的油基，制备的人乳脂类似物乳液有较好的前景；然而，该方面的研究还较少[9]。

婴幼儿配方乳液通常采用高压均质技术获得，如DRAPALA等[10]以大豆油为油基采用两步高压均质法制备婴幼儿配方乳液，重点研究了水解乳清蛋白和麦芽糖糊精的结合物对乳液热稳定性的影响；ZOU等[11]以酶法制备的结构脂为芯材采用高压均质法(34.47～48.26 MPa)制备婴幼儿配方乳液，研究了抗氧化剂对该乳液氧化稳定性的影响。超声辅助高速均质乳化法具有操作简单，形成乳液粒径小、分布窄，高稳定性等特点[12-16]。然而，关于利用超声辅助高速均质乳化法制备婴幼儿配方乳液的研究尚未见报道，乳液的形成规律尚未明确。

本研究以更为经济的分提方式制得富含OPO的猪油，同其他油料调配获得人乳脂类似物，并以此为分散相，通过对人乳脂类似物乳液的制备工艺进行优化，重点考察了蛋白质、人乳脂类似物和磷脂的添加量以及超声时间、功率对乳液形成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清蛋白(CAS# 9006-59-1，纯度为81.47%)、酪蛋白(CAS# 9000-71-9)和大豆卵磷脂(CAS# 8002-43-5),合肥博关生物科技有限公司；37种脂肪酸甲酯混合标准品(CRM 47885)，Sigma-Aldrich(中国)公司；大豆油，重庆红蜻蜓油脂有限责任公司；猪油，重庆市北碚区天生路永辉超市；油茶籽油，江西春源绿色食品有限公司；椰子油，上海冉浩实业有限公司；猪胰脂肪酶(CAS# 9001-62-1)，合肥博美生物技术有限责任公司；乙醚、正己烷、石油醚、甲醇、KOH、胆酸钠、HCl等试剂均为分析纯，重庆市钛新化工公司；超纯水,由东莞亚仕兰YSL-RO-15L/H型实验室超纯水机制得。

1.2 仪器与设备

BZY-3B型自动表/界面张力仪，上海衡平仪器仪表厂；Zetasizer Nano ZS90型激光粒径仪，英国Malvern公司；T18 ULTRA-TURRAX型高速均质机、RW20 DIGITAL型电动搅拌机、Topolino型磁力搅拌器，德国IKA公司；JY98-IIIDN型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；MX-S可调式漩涡振荡器，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；GC-2010型气相色谱仪，日本岛津科技有限公司；PB-10 标准型pH计，德国赛多利斯公司。

1.3 试验方法

1.3.1 人乳脂类似物的调配

根据人乳脂的脂肪酸结构、组成以及人乳脂类似物调配数学模型[17]，以33L-猪油(经干法分提得到33 ℃呈液体部分)为基础油料，与油茶籽油、大豆油和椰子油进行调配得到人乳脂类似物，采用气相色谱测定其脂肪酸组成与分布。将其充入氮气保存于-20 ℃，用于制备人乳脂类似物乳液。

1.3.2 乳液的制备

采用超声辅助高速均质法制备人乳脂类似物乳液。首先，制备水相，分别称取一定质量的磷脂、乳清蛋白、酪蛋白于烧杯中，加超纯水于30 ℃下磁力搅拌2 h，添加叠氮化钠溶液(最终浓度为0.02%)抑菌，调节水相的pH值为6.8，置于4 ℃静置12 h使其中的蛋白质充分溶胀。然后，将一定质量的人乳脂类似物添加于水相，搅拌(500 r/min，5 min)后高速均质(20 000 r/min，2 min)，获得粗乳液。最后，采用超声处理粗乳液(工作时间为5 s，间歇3 s)，用冰水浴使温度不超过30 ℃，得到的人乳脂类似物乳液用于后续粒径、分布系数(polydispersity index，PDI)、zeta电位、表面张力和外观观察等性能表征。

表1 均匀设计因素水平Table 1 Factors and levels of uniform design

根据GB 10767—2010 《较大婴幼儿配方食品》 中规定[18]：即食状态下较大婴幼儿配方食品每100 mL所含能量应不低于250 kJ，且每100 kJ能量中蛋白质为0.7～1.2 g，脂肪为0.7～1.4 g。与前期预实验结果相结合，确定考察因素及范围：超声时间(2～32 min)，超声功率(60～660 W)，蛋白质(1.75%～3.1%，基于乳液的总质量计算的质量分数)、人乳脂类似物(1.75%～3.55%，基于乳液的总质量计算的质量分数)和磷脂(0.05%～0.5%，基于乳液的总质量计算的质量分数)，用DPS 7(data processing system 7)数据系统处理U12(122×53) 混合水平均匀设计方案，因素水平见表1。探究不同因素对人乳脂肪类似物乳液的粒径、zeta电位、PDI和表面张力的影响。

1.3.3 检测方法

1.3.3.1 人乳脂类似物的总脂肪酸组成测定

采用KOH-甲醇酯化法对人乳脂类似物进行甲酯化，具体操作参考胡烨敏等[19]的方法并加以改进。准确吸取10 μL油料于15 mL离心管中，加入2 mL正己烷，振荡样品充分溶解；加入2 mL 0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液，于45 ℃条件下充分振荡5 min，静置5 min，加入6 mL饱和NaCl溶液，摇匀10 s后离心(5 000 r/min，5 min)，吸取上层正己烷(含脂肪酸甲酯)，待气相色谱检测。气相色谱的检测条件：色谱柱：DB-23毛细管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气：N2；流量：1.0 mL/min；分流比为50∶1；进样量：1 μL；进样口温度为250 ℃；FID 检测器温度为280 ℃；初始柱温度为60 ℃，以7 ℃/min升至220 ℃，保持35 min。以37种脂肪酸甲酯混合标准品为参考，并采用面积归一法计算脂肪酸的相对含量。

1.3.3.2 人乳脂类似物的sn-2位脂肪酸组成测定

参照覃小丽等[20]的方法，以酶法水解油样并采用硅胶薄层层析法对水解产物进行分离，获得sn-2位单甘酯进行甲酯化和气相分析，方法条件和步骤见1.3.3.1。

1.3.3.3 乳液的粒径、PDI及zeta电位的测量

采用Zetasizer Nano ZS 90激光粒径仪测定人乳脂类似物乳液的粒径、PDI和zeta电位情况。为了尽量降低多重光散射效应，将乳液用超纯水稀释1 000倍。水相溶液的折射率设置为1.33，测试温度为25 ℃，平衡时间为2 min。样品平行测定两组，每组测定3次，每次测量值为13个子测试运行结果的平均值。

1.3.3.4 表面张力的测定

采用表面张力测量仪在(23±1)℃下测定乳液的表面张力。取一定体积乳液加入样品池中，调节粗调旋钮、微调旋钮使铂金片与乳液接触，并读取数值。每个样品至少重复测定3次，确保证测量差值在1 mN/m以内。

1.3.3.5 乳液的外观

将鲜乳液装入10 mL螺口玻璃瓶，在25 ℃下静止放置，定期观察人乳脂类似物乳液体系的变化，包括是否有油滴析出、絮凝沉淀、乳液分层等现象。观察若干天，文字记录现象并拍照。

1.3.4 数据处理与统计

实验结果以平均值±标准差表示。本研究对多组间平均值的比较采用SPSS 18.0软件进行one-way ANOVA 及Duncan分析，p<0.05为显著性差异，并采用DPS 7数据统计软件对均匀设计相关数据进行二次回归统计分析。

2 结果与分析

2.1 人乳脂类似物的脂肪酸组成与分布

人乳脂的脂肪酸组成及其分布是制备人乳脂类似物的黄金原则[21]，选择4种油料(油茶籽油、大豆油、椰子油、33L-猪油)进行调配得到人乳脂类似物。由表2可看出，油茶籽油富含不饱和脂肪酸(如C18∶1n-9和C18∶2n-6总脂肪酸含量分别为79.63%和7.70%)作为人乳脂类似物中不饱和脂肪酸的主要来源。椰子油富含中碳链脂肪酸，其中C10∶0和C12∶0总脂肪酸含量分别为6.04%和53.37%，为人乳脂类似物提供中碳链脂肪酸。大豆油含有较丰富的必需脂肪酸(如C18∶3n-3总脂肪酸含量为5.15%，C18∶2n-6总脂肪酸含量可达53.56%)，有助于调节人乳脂类似物中C18∶2n-6/C18∶3n-3值，人乳脂中C18∶2n-6/C18∶3n-3的比值在5～15时有助于婴儿的智力发育和视力[22]。

表2 各种油脂的总脂肪酸组成 单位：%

注：C10∶0为癸酸；C12∶0为月桂酸；C14∶0为肉豆蔻酸；C16∶0为棕榈酸；C18∶0为硬脂酸；C18∶1n-9为油酸；C18∶2n-6为亚油酸；C18∶3n-3为亚麻酸；—表示未检出。表3同。

表3 各种油脂的sn-2位脂肪酸组成 单位：%

猪油由于其特殊的脂肪酸组成和甘油酯结构是制备人乳脂类似物的最佳原料之一。由表2和表3可知，33L-猪油中C16∶0总脂肪酸和sn-2位脂肪酸含量分别为25.76%和69.25%，由此可知sn-2位棕榈酸相对含量可达89.61%；C18∶1n-9总脂肪酸和sn-2位脂肪酸含量分别为36.42%和10.52%，由此可计算其在sn-1,3位的相对含量90.37%。这提示该33L-猪油富含OPO，能够从甘油三酯结构层面上为制备与人乳脂高度相似的人乳脂类似物提供保障。

结合上述，根据4种油的脂肪酸组成及分布的特点，以及人乳脂的脂肪酸组成及分布的准则[1]，采用软件SPSS 18计算上述4种原料油脂，按比例(19.78%油茶籽油、15.15%大豆油、10.28%椰子油和50.80% 33L-猪油)进行调配得到人乳脂类似物。由表2可知，人乳脂类似物中总脂肪酸含量均在人乳脂的参考范围内，其中C18∶2n-6/C18∶3n-3的比值为12.82。此外，结合表2、表3可计算出人乳脂类似物中sn-2位棕榈酸相对含量可达67.03%，与人乳脂中sn-2位棕榈酸相对含量(>70%)接近，这表明调配制备的人乳脂类似物在脂肪酸结构上与人乳脂具有较好的相似性。人乳脂类似物在其制备工艺(经干法分提获得的33-L猪油为基础调配获得)上，与酶法合成的OPO相比，具有简单易操作等优势。

2.2 人乳脂类似物乳液的影响因素

以5个因素(蛋白质、人乳脂类似物和磷脂的添加量及超声时间和功率)为自变量，采用均匀设计对超声辅助高速均质法制备人乳脂类似物乳液形成的影响因素进行探讨，结果见表4。并通过DPS 7软件对实验数据进行二次多项式逐步回归处理，建立指标模型概况见表5。

表4 混合均匀设计表及实验结果Table 4 Design of mixed uniform and experimental results

表5 指标模型概况Table 5 Summary of the model parameters

由均匀设计结果可知，乳液的PDI(0.17～0.23)和Zeta电位(-37.0～-40.2 mV)变化范围较小，且有研究表明PDI<0.2 和Zeta电位小于-30 mV，乳液粒径分布比较均一，单体聚合的稳定性良好[23-24]，故不选择以PDI和Zeta电位为指标进行乳液制备条件的优化。此外，鉴于乳液粒径在均匀设计组中变化幅度(约63 nm)较大，所以选取粒径的模型进行最佳条件的确定。对粒径回归模型进行预测分析，得到预测的优化条件：超声功率为108 W，超声时间为32 min，蛋白质添加量为2.76%，人乳脂类似物添加量为1.75%，磷脂添加量为0.5%。

2.3 最佳工艺的验证试验

按照优化条件进行验证试验(n=3)，得到的人乳脂类似物乳液粒径为(169.5±1.30 )nm(n=3)，与预测值(173.8 nm)相吻合。对该乳液进行19 d储藏试验发现，粒径在7 d内变化幅度不大(第7天的粒径为184.7 nm)，而之后的储藏中，粒径上升趋势较陡峭并在19 d后到达283.9 nm，说明乳液在7 d内稳定性较好；此外，乳液在储藏过程中，其PDI和zeta电位变化均较小，且都在可接受范围内(图1)。

图1 储藏时间对人乳脂类似物乳液粒径、PDI和Zeta电位的影响Fig.1 Effect of storage time on average particle size, PDI and Zeta potential of human milk fat analogue emulsion注：图1中不同小写字母表示组间平均值有显著差异(p<0.05)。

由图2可得，比较第1天和第19天的粒径分布，表明第19天相对第1天的粒径分布图向右偏移，可能是由于乳液的液滴之间相互聚集导致粒径偏大，与图1中粒径变化趋势一致。

此外，储藏19 d后乳液外观未出现明显分层，只是液面上出现一层非常薄的乳白色絮状物，这可能由于乳液中部分粒径较大的液滴发生聚集而形成。总之，通过超声辅助高速均质法可获得物理稳定的人乳脂类似物乳液，为后续研究婴儿配方乳液的功能调控提供技术支持。

图2 第1天和第19天人乳脂类似物乳液粒径分布和外观图Fig.2 Particle size distribution and appearance of human milk fat analogue emulsion at 1 and 19 day

3 总结

本研究以33-L猪油(富含OPO)为主要油料调配成人乳脂类似物，脂肪酸组成与人乳脂类相近，并且其sn-2位棕榈酸相对含量可达67.03%，C18∶1n-9在sn-1,3位的相对含量78.28%，这说明人乳脂类似物在脂肪酸的结构上能更好地模拟人乳脂。以上述人乳脂类似物为油脂芯材，采用均匀设计优化超声辅助高速均质法制备人乳脂类似物乳液，建立了影响乳液粒径的条件优化模型，获得的乳液最小粒径可达169.5 nm。对该模型进行分析可知，影响乳液粒径的主要因素为超声时间和蛋白质的添加量；在一定范围内，延长超声时间和增加蛋白质含量有利于减小乳液的粒径。通过采用均匀设计优化人乳脂类似物乳液的制备工艺可得到物理稳定性好的乳液，以期为新一代婴儿配方乳液的制备提供提供重要理论依据和技术支持。