固相萃取-气相色谱-火焰光度法同时测定植物性肽粉中42种有机磷农药残留

安红梅，柯润辉*，王丽娟，杨春艳，黄新望，田菲菲，尹建军

1(中国食品发酵工业研究院, 北京，100015) 2(岛津企业管理(中国)有限公司, 北京，100020)

植物性肽粉是植物蛋白(如大豆蛋白、玉米蛋白等)的水解产物，经后续处理、精炼后得到的低肽混合物，具有抗菌、抗氧化、抗疲劳、调节免疫、血管紧张素转换酶抑制作用等众多的生理活性[1-3]，被广泛应用在功能饮料、保健品、功能食品及医用食品领域，是当今保健食品和生物医药领域的研究热点之一[4]。目前对肽的研究多集中在其生物功效与作用方面[2, 5]，而对其安全指标的研究还较少。由于大豆、玉米等农作物在种植过程中不可避免地会使用化学农药，由此所带来的农药残留问题不容小觑。经文献查询，国内尚未见到有关植物性肽粉及制品中农药残留研究的报道。为保障植物性肽粉的食用安全性，避免因农药残留问题给消费者的健康和行业声誉带来损害，同时为完善肽生产企业质量安全控制体系，有必要开发适用于植物性肽粉及制品中简单、高效、通用性强的农药日常监测方法。

有机磷农药是用于防治植物病虫害应用量最大，应用面最广的农药品种之一，多数属剧毒或高毒类，对人体有极大的危害[6]。研究表明，有机磷农药经过皮肤、呼吸以及肠胃吸收等途径进入人体后，会危害中枢神经系统从而出现急性中毒症状或者慢性累积效应[7]。目前，有机磷农药的检测方法主要有气相色谱法(GC)[8]、气相色谱-质谱法[9]、气相色谱-三重四极杆串联质谱法[10]、酶联免疫法(ELISA)[11]、液相色谱-串联质谱法[12]等。质谱法虽具有较高的灵敏度， 但其检测投入大、 运行成本高、 对使用人员的素质要求亦较高[13]；ELISA法虽特异性较强，但酶制剂易失活容易导致反应不稳定、重复性差[14]；气相色谱-火焰光度检测器(FPD)法具有选择性强、灵敏度高、稳定性好，受基质效应影响较小、仪器成本较低且普及率高等优点，因此广泛应用于有机磷农药的残留分析中。本文应用乙腈作为提取溶剂，经石墨化炭黑氨基复合SPE柱净化，气相色谱-火焰光度法检测，建立了同时测定植物肽粉中42种有机磷农药的方法，操作简单，灵敏度高，能够满足植物肽粉及其制品中有机磷农药残留的检测和日常监控的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙酸乙酯、甲苯、乙腈、正己烷和丙酮(均为色谱纯)，美国J.T.Baker公司；NaCl(分析纯),国药集团化学试剂有限公司；弗罗里硅土(Florisil)固相萃取柱、石墨化炭黑-氨基复合固相萃取柱(500 mg/6 mL), 天津博纳艾杰尔科技有限公司。

有机磷农药标准溶液：敌敌畏、速灭磷、乙酰甲胺磷、虫线磷、异吸硫磷、甲拌磷、氧乐果、特丁硫磷、百治磷、巴胺磷(胺丙磷)、八甲磷、乙拌磷、磷胺、乐果、甲基对硫磷、对氧磷、地毒磷、毒死蜱、马拉硫磷、嘧啶磷、倍硫磷、水胺硫磷、灭蚜磷、喹硫磷、氯唑磷、稻丰散、抑草磷、杀虫畏、苯线磷、乙拌磷砜、灭菌磷、乙硫磷、硫丙磷、三硫磷、敌瘟磷、三唑磷、苯硫磷、苯线磷亚砜、 莎陴磷、溴苯磷、亚胺硫磷、吡菌磷(100 mg/L，农业部环境保护科研监测所)。

3个玉米肽粉，2个大豆肽粉，2个山药肽粉，3豌豆肽粉，共10个样品，购自当地药店、超市。

1.2 仪器与设备

气相色谱仪(GC-2010 PLUS，配有FPD检测器)，日本岛津公司；氮气吹干仪(DC-12)，上海安谱实验科技股份有限公司；数控超声波清洗器(KQ5200 DB)，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪(RE-52AA)，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 标准溶液的配制

分别准确移取上述42种有机磷农药标准储备液0.2 mL，用甲苯定容至10 mL，得到质量浓度为2 mg/L的混合标准中间溶液，0～4 ℃保存备用。使用前移取适量的混合标准中间溶液，用甲苯逐级稀释成适当浓度的混合标准使用液。

1.4 样品制备

1.4.1 提取

称取植物性肽粉试样10.00 g于50 mL具塞离心管中，加入40 mL乙腈(对比实验为等量的丙酮、乙酸乙酯)和5 g NaCl，剧烈振荡5 min，超声30 min，6 000 r/min离心6 min，准确取出20 mL上清液于50 mL鸡心瓶中，于38 ℃旋转蒸发至2 mL，待净化。

1.4.2 净化

石墨化炭黑-氨基复合柱净化：用5 mL乙腈-甲苯(体积分数为75%)润洗石墨化炭黑-氨基复合固相萃取小柱，保持柱体湿润，将上述提取浓缩液上柱，收集流出液，再用5 mL乙腈-甲苯(体积分数为75%)洗涤鸡心瓶，并上柱，再加入20 mL乙腈-甲苯(体积分数为75%)洗脱液，保持流速1 mL/min，合并流出液，于38 ℃水浴旋转蒸发至近干，用1mL甲苯溶解，上GC-FPD检测。

Florisil固相萃取柱净化：分别用丙酮-正己烷(体积分数为10%) 和正己烷5 mL润洗Florisil固相萃取柱，保持柱体湿润。将上述提取浓缩液氮吹干，用2 mL正己烷复溶，上柱，收集流出液，再用5 mL丙酮-正己烷(体积分数为10%)洗涤鸡心瓶，并上柱，再加入5 mL丙酮-正己烷(体积分数为10%)洗脱液，保持流速1 mL/min，合并流出液，于38 ℃水浴旋转蒸发至近干，用1 mL甲苯溶解，上GC-FPD检测。

1.5 气相色谱条件

色谱柱为DB-17MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国安捷伦J&W公司)；载气为高纯度氮(纯度99.999%)；恒流模式，柱流速为1.00 mL/min；进样口温度250℃；无分流进样，进样量1 μL；FPD检测器温度300 ℃，氢气流量为62.5 mL/min；空气流量为90.0 mL/min。

升温程序：初始温度100 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速率升至210 ℃，以5 ℃/min的速率升至260 ℃，保持8 min，以8 ℃/min的速率升至280 ℃，保持3 min，总运行时间为39 min。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

2.1.1 提取溶剂的确定

在提取过程中，提取溶剂的选择会直接影响待测物的回收率。通过查阅相关文献[15-17]，同时结合有机磷农药的溶解性，实验比较了丙酮、乙腈、乙酸乙酯作为肽粉中有机磷农药的提取剂，对3种提取剂的加标回收率进行比较。实验结果表明，用乙腈提取时各农药的回收率为79.5%～101.3%，明显高于乙酸乙酯(回收率为52.9%～78.1%)(图1)。用丙酮的提取时各农药的回收率为75.6%～93.6%，与乙腈相差不大，但是其共提取的杂质相对较多，故实验最后选择为乙腈作为提取溶剂。

2.1.2 固相萃取条件的选择

Florisil柱、C18柱、石墨化炭黑/氨基复合柱(PestiCarb/NH2柱)是农残分析常用的固相萃取净化柱，其中PestiCarb/NH2固相萃取柱上层是活性炭，脱色效果明显，下层氨基能和糖类、蛋白质、脂肪中的相关基团形成氢键从而去除基质中的大部分干扰物[18]；C18柱主要可去除基质中脂肪等非极性杂质[19], 但由于植物肽粉样品中多为氨基酸组成的低肽段，脂肪含量较低，故无需用C18柱净化。试验比较了Florisil柱和PestiCarb/NH2固相萃取柱净化试样对回收率的影响。结果表明: Florisil柱和PestiCarb/NH2固相萃取柱在有机磷农药的净化方面效果相当，平均回收率分别为86.6%和90.2%，但由于Florisil柱在净化过程中某些农药，如氯唑磷、甲基对硫磷、吡菌磷等农药的平均回收率偏低(分别为71.1%、80.8%和72.0%)，与使用PestiCarb/NH2柱相比有一定差距(平均回收率分别为88.7%、103.8%和85.6%)(图2)，同时使用PestiCarb/NH2柱净化后的溶液颜色比使用Florisil柱浅，除色素的能力较强。因此，最终选择PestiCarb/NH2柱作为固相萃取净化柱。

2.2 方法的基本性能

2.2.1 线性范围及测定低限

使用玉米肽粉作为代表，取其空白样品提取溶液作为基质匹配标准溶液的稀释液, 将2 mg/L 的混合标准中间液逐级稀释至浓度为1.00、0.50、0.20、0.10、0.05 mg/L的基质匹配混合标准溶液进行测定, 以质量浓度对相应的峰面积绘制标准曲线, 求得线性方程及相关系数。在0.05～1.00 mg/L范围内线性关系良好, 相关系数R2大于0.99。以S/N=3计算方法中各种有机磷农药的检出限(LOD)，其范围为0.005～0.02 mg/kg；以S/N=10作为分析方法的定量低限，其范围为0.015～0.060 mg/kg，见表1。图3为浓度为0.10 mg/L的42种有机磷农药基质匹配标准溶液的GC-FPD谱图。

表1 42种有机磷农药的线性范围、相关系数、检出限Table 1 The retain time, linear range, correlation coefficient, and detection limit of 42 organophosphorus pesticides

续表1

名称保留时间/min线性方程线性范围/(mg·L-1)相关系数检出限/(mg·kg-1)定量限/(mg·kg-1)磷胺216.079Y=3.6×105X+6 2580.05～1.000.993 60.0180.054甲基对硫磷16.571Y=2.9×106X+30 5440.05～1.000.999 30.0050.015对氧磷16.644Y=1.4×106X+25 5500.05～1.000.999 60.0100.030地毒磷16.847Y=2.5×106X+10 2780.05～1.000.999 40.0050.015毒死蜱16.986Y=2.7×106X+50 0020.05～1.000.999 10.0050.015马拉硫磷17.126Y=2.3×106X+33 6120.05～1.000.999 30.0080.024嘧啶磷17.298Y=2.6×106X+10 2110.05～1.000.998 90.0050.015倍硫磷18.069Y=2.7×106X+30 2780.05～1.000.999 60.0050.015水胺硫磷18.65Y=2.5×106X+20 5890.05～1.000.999 50.0080.024灭蚜磷18.914Y=2.5×106X+35 7840.05～1.000.995 60.0080.024喹硫磷19.307Y=2.5×106X+68 4510.05～1.000.999 60.0080.024氯唑磷19.509Y=2.4×106X+20 3890.05～1.000.999 30.0080.024稻丰散19.591Y=1.5×106X+50 2230.05～1.000.999 10.0120.036抑草磷19.977Y=2.5×106X+20 3640.05～1.000.999 40.0080.024杀虫畏20.133Y=1.8×106X+56 9410.05～1.000.999 30.0100.030苯线磷20.503Y=1.5×106X+10 3690.05～1.000.999 20.0120.036乙拌磷砜21.08Y=1.4×106X+36 9980.05～1.000.996 30.0120.036灭菌磷21.223Y=2.5×106X+40 2810.05～1.000.999 10.0080.024乙硫磷22.232Y=2.8×106X+13 7990.05～1.000.999 50.0050.015硫丙磷23.067Y=2.2×106X+44 1150.05～1.000.997 20.0100.030三硫磷23.458Y=1.4×106X+28 9940.05～1.000.999 20.0150.045敌瘟磷24.502Y=5.0×105X+5 2440.05～1.000.999 60.0150.045三唑磷25.045Y=1.4×106X+45 8790.05～1.000.999 30.0150.045苯硫磷27.435Y=1.1×106X+23 6600.05～1.000.999 70.0150.045苯线磷亚砜28.128Y=3.0×105X+6 2310.05～1.000.999 00.0180.054莎陴磷29.028Y=6.0×105X+5 8770.05～1.000.997 20.0150.045溴苯磷29.635Y=7.0×105X+6 3000.05～1.000.998 50.0150.045亚胺硫磷30.348Y=6.0×105X+8 0990.05～1.000.999 10.0150.045吡菌磷31.017Y=7.0×105X+4 0560.05～1.000.998 90.0150.045

图3 42种有机磷农药的GC-FPD谱图(0.10 mg/L)Fig.3 GC-FPD chromatogram of 42 organophosphorus pesticides(0.10 mg/L)1-敌敌畏；2-速灭磷；3-乙酰甲胺磷；4-虫线磷；5-异吸硫磷；6-甲拌磷；7-氧乐果；8-特丁硫磷；9-百治磷；10-巴胺磷(胺丙磷)；11-八甲磷；12-乙拌磷；13-磷胺1；14-乐果；15-磷胺2；16-甲基对硫磷；17-对氧磷；18-地毒磷；19-毒死蜱；20-马拉硫磷；21-嘧啶磷；22-倍硫磷；23-水胺硫磷；24-灭蚜磷；25-喹硫磷；26-氯唑磷；27-稻丰散；28-抑草磷；29-杀虫畏；30-苯线磷；31-乙拌磷砜；32-灭菌磷；33-乙硫磷；34-硫丙磷；35-三硫磷；36-敌瘟磷；37-三唑磷；38-苯硫磷；39-苯线磷亚砜；40-莎陴磷；41-溴苯磷；42-亚胺硫磷；43-吡菌磷

2.2.2 回收率和精密度实验

为考察方法的准确性, 按照所确定的方法，选取某一空白玉米肽粉样品在相应线性范围内进行2个水平的添加回收率试验，每个水平做6 个平行样品测定。结果表明，玉米肽粉中42种有机磷平均回收率均在72.8%～103.8%，相对标准偏差(RSD)范围为2.44%～8.71%(表2)，该方法的回收率和RSD均符合检测要求[20]。

2.3 实际样品分析

为验证方法的可行性，采用实验建立的方法对10种市售植物肽粉样品(3玉米肽粉，2个大豆肽粉，2个山药肽粉，3豌豆肽粉)进行分析。若为阳性样品，需经极性不同色谱柱进行双柱检验或质谱确证。实验结果表明，10种植物性肽粉中42种有机磷农药均未检出，在一定程度上说明市面上植物性肽粉质量具有可靠性。

表2 42种有机磷农药的回收率及其精密度(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSD of 42 organophosphorus pesticides (n=6)

续表2

名称添加浓度0.05 mg/kg添加浓度0.5 mg/kg平均回收率/%RSD/%平均回收率/%RSD/%乙酰甲胺磷72.86.3178.98.71虫线磷88.24.6189.13.01异吸硫磷80.34.0290.22.98甲拌磷90.64.1893.12.73氧乐果80.65.0382.68.59特丁硫磷89.73.9988.13.05百治磷88.74.2290.63.66胺丙畏(巴胺磷)91.54.3691.62.87八甲磷90.83.8992.13.66乙拌磷84.64.3988.72.85磷胺177.46.0780.37.94乐果92.45.8490.66.05磷胺276.76.7177.68.13甲基对硫磷81.44.06103.83.16对氧磷94.63.6992.52.44地毒磷89.14.7890.62.69毒死蜱91.53.6998.73.14马拉硫磷93.74.1293.52.85嘧啶磷88.13.6485.72.89倍硫磷82.64.8980.63.61水胺硫磷90.85.0194.44.01灭蚜磷84.65.3390.33.75喹硫磷91.74.2394.82.99氯唑磷88.75.6492.63.33稻丰散93.13.1890.82.45抑草磷84.54.5585.13.82杀虫畏85.63.8984.93.01苯线磷90.54.2188.73.46乙拌磷砜76.73.6998.32.89灭菌磷88.33.4795.63.01乙硫磷80.53.8490.72.55硫丙磷92.64.0392.32.59三硫磷86.15.0189.43.75敌瘟磷84.33.6688.62.86三唑磷85.74.0591.33.06苯硫磷82.13.6685.62.57苯线磷亚砜82.33.7887.43.16莎陴磷90.64.0890.63.06溴苯磷85.84.6688.14.02亚胺硫磷79.43.7982.63.19吡菌磷78.35.0485.63.38

3 结论

本文建立了植物性肽粉中同时测定42种有机磷农药的GC-FPD分析方法，通过乙腈提取，PestiCarb/NH2固相萃取柱净化，在选定的色谱条件下可以实现植物肽粉中42种有机磷农药的分离与定量。该方法在0.05～1.00 mg/L范围内线性关系良好, 相关系数R2大于0.99，最低检出限为0.005～0.020 mg/kg；在0.05～0.5 mg/kg 的添加水平，42种有机磷的平均回收率在72.8%～103.8%，相对标准偏差在2.44%～8.71%，该方法具有良好的回收率和精密度，可用于植物性肽粉及其制品中有机磷农药的检测，且能够满足我国食品中农药残留限量标准GB 2763—2014的检测需求。