酿酒酵母合成番茄红素的适配性优化

2018-07-18李霞赵金雨娄兴丹张根林

食品与发酵工业 2018年6期

李霞，赵金雨，娄兴丹，张根林

(石河子大学化学化工学院，新疆兵团化工绿色过程重点实验室，新疆石河子，832003)

番茄红素(lycopene)是一种抗氧化活性很强的萜类物质，具有猝灭单线态氧、清除自由基、抑制脂质过氧化等多种生理功能活性[1-2]，在癌症预防，抗衰老，保护心脑血管和增强机体免疫力等方面有广泛应用，被世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)认定为A类营养素，市场前景较好[3-4]。目前生产番茄红素常用的方法有直接提取法、化学合成法和微生物发酵法。由于原料番茄的供应受到气候与季节的影响，使得直接提取法生产成本较高[5]。化学合成法一般以β-紫罗酮为原料，合成过程步骤繁琐，且化学试剂残留问题限制了产品的使用范围[6]。而微生物发酵法由于不受气候和季节影响、生产周期短、易于大规模培养等优势逐渐受到人们的关注。酿酒酵母因具有遗传可操作性以及成熟的大规模培养技术使其在食品工业中被广泛应用[7-8]。作为安全的模式微生物，酿酒酵母存在能合成萜类的甲羟戊酸(MVA)途径，已经作为生产青蒿酸[9]、玉米黄质[10]、β-香树脂醇[11]、人参皂苷[12]等天然产物的优良宿主使用。通过引入外源的八氢番茄红素合成酶(CrtB)、八氢番茄红素去饱和酶(CrtI)可以实现在酿酒酵母中合成番茄红素[13](图1)。如YAMANO等将欧文氏菌的番茄红素合成基因引入酿酒酵母中，获得了产量为113 μg/g番茄红素[13]；王贝贝等将红法夫酵母的CrtBY和CrtI基因导入酿酒酵母，番茄红素的产量达到0.4 mg/g[14]；施明雨等将成团泛菌来源的番茄红素合成基因引入酿酒酵母后，番茄红素产量达到13.23 mg/L[15]。研究认为，合成途径与宿主的适配性、宿主的生理状态仍然是限制番茄红素高效合成的重要因素，难以进行全局调控[13-15]。因此，本研究从宿主选择、途径表达的适配性等方面综合考虑，研究底盘宿主、启动子以及前体物库容对番茄红素合成与细胞生长的影响，为进一步优化酿酒酵母合成番茄红素提供参考。

ERG10-乙酰乙酰辅酶A转移酶基因；ERG13-HMG辅酶A合酶基因；tHMG1-HMG辅酶A还原酶基因；ERG12-甲羟戊酸激酶基因；ERG8-磷酸甲羟戊酸激酶基因；ERG19-磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因；IDI-IPP异构酶基因；ERG20-FPP合酶基因；BTS1-GGPP合酶基因； CrtB-八氢番茄红素合酶基因；CrtI-八氢番茄红素脱氢酶基因图1 酿酒酵母合成番茄红素的途径优化策略Fig.1 Strategy for construction of lycopene biosynthetic pathway

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器

高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶、RNA反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒PCR试剂盒、限制性内切酶SalI、BamH I购自大连宝生物工程有限公司；核酸Marker、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒、酵母DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；氨苄青霉素、潮霉素、G418、半乳糖、番茄红素标准品购自索莱宝生物科技有限公司。

T100型PCR仪，Bio-Rad公司；LightCycler 96型荧光定量PCR仪，瑞士Roche公司；MLS33750型高压灭菌器，日本三洋公司；5810R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；LC-A10型液相色谱仪，日本岛津公司；GC2010型气相色谱仪，日本岛津公司。

1.1.2 培养基

LB培养基：酵母浸出粉5 g/L、蛋白胨10 g/L和NaCl 10 g/L。固体培养基添加15 g/L的琼脂粉。LB培养基用于大肠杆菌的培养。

BMMY培养基：酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨20 g/L和半乳糖20 g/L。固体培养基添加20 g/L的琼脂粉。BMMY培养基用于含有诱导型启动子酿酒酵母工程菌的培养。

YPD培养基：酵母浸出粉10 g/L、蛋白胨20 g/L和葡萄糖20 g/L。固体培养基添加20 g/L的琼脂粉。YPD培养基用于酿酒酵母的培养。

毕宏生是第十二届、十三届全国人大代表，著名眼科专家，从事眼科临床、教学及科研工作30多年，在白内障、视光及采用眼显微外科手术解决复杂疑难性眼病、中西医结合眼病的临床及研究领域均取得突出成就。他还高度关注民生工程，注重承担社会职责，连续多年为防盲治盲奔波劳力，多次协助政府推动重大公共卫生项目。活动中，毕宏生不仅介绍了眼科常见病保健知识，还积极呼吁全社会要高度重视眼健康，关注青少年视力保健。

1.1.3 菌种与质粒

研究所需的菌种与质粒见表1。

表1 菌种和质粒Table 1 The strains and plasmids

1.2 方法

1.2.1 表达载体和酵母工程菌的构建

以酿酒酵母基因组为模板，利用特异性引物扩增启动子GAL1p、GAL7p、TEF1p、FBA1p和终止子CYC1t、TYS1t。以质粒pUC57-CrtB和pUC57-CrtI为模板，扩增分别获得来源于欧文氏菌的八氢番茄红素合成酶基因CrtB(GenBank: KC954270.1)和来源于红法夫酵母的八氢番茄红素脱氢酶基因CrtI(GenBank:AY177424.1)。然后通过重叠延伸PCR方法构建获得基因表达盒GAL1p-CrtB-CYC1t、GAL7p-CrtI-TYS1t、TEF1p-CrtB-CYC1t和FBA1p-CrtI-TYS1t。用限制性内切酶SalI和BamH I对质粒pRS41H和pRS42K进行线性化。线性化的质粒和基因表达盒通过醋酸锂转化法转化到酿酒酵母中，利用酿酒酵母的同源重组实现组装[16]，形成含有不同表达途径质粒的工程酵母(表2)。为了平衡酿酒酵母MVA途径的库容，选择rDNA重复单元序列作为MVA途径基因表达盒的整合位点，设计了如图2的构建策略，形成工程酵母W5和W6(表2)。

ADH1p、ALA1p、FBA1p、TDH3p、TYS1p、GPM1p、TEF1p-启动子；SDH2t、ILV1t、VPS8t、PIM1t、REI1t、LRP1t、 CYC1t-终止子，hphNT1-潮霉素B抗性筛选标记基因图2 MVA途径优化设计示意图Fig.2 Schematic diagram of MVA pathway optimization

1.2.2 酵母工程菌的筛选

利用pRS41H或pRS42K为载体、使用半乳糖诱导型启动子GAL1p和GAL7p控制番茄红素合成途径时，转化所得的酵母工程菌使用BMMY抗性培养基培养；利用pRS41H或pRS42K为载体、使用组成型启动子TEF1p和FBA1p控制番茄红素合成途径时，转化所得的酵母工程菌使用YPD抗性培养基培养。转化后的细胞均置于30 ℃培养箱中倒置培养，直至长出菌落，经菌落颜色变化(合成番茄红素的菌株显粉红色)和菌落PCR筛选获得阳性克隆菌株。

1.2.3 酵母工程菌的发酵

1.2.4 番茄红素的提取

菌株发酵结束后，采用改进的XIE等提取类胡萝卜素的方法[17]。取发酵液50 mL转入离心管中，8 000 r/min离心5 min弃上清，无菌水清洗沉淀2次后加入10 mL 3 mol/L的HCl溶液，混合均匀后沸水浴4 min，迅速放入冰水浴冷却3 min，8 000 r/min离心5 min弃去上清，无菌水清洗沉淀2次后倒掉上清，加入10 mL丙酮，并加少量石英砂涡旋混合细胞5 min，最后充分萃取脂溶性代谢产物，8 000 r/min离心5 min，上清液用0.22 μmol/L有机滤膜过滤后用高效液相色谱仪分析番茄红素的含量。

1.2.5 番茄红素的测定

使用高效液相色谱仪对番茄红素进行定量测定。所用液相色谱仪为岛津LC-10A，检测器为PDA检测器，色谱柱为ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=21∶21∶8，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长470 nm。每个待测样品平行测定3次。

1.2.6 中间代谢产物的提取及测定

酿酒酵母中角鲨烯、法尼醇等代谢产物的提取参照文献报道进行[18]。使用气相色谱仪进行测定。所用气相色谱仪为岛津GC2010，色谱柱为 TG-5MS(Thermo 30 m×0.25 mm×0.25 μm)，FID检测器温度为300 ℃，分流进样，载气为氮气，进样量1 μL，分流比30∶1，进样口温度为250 ℃，柱箱程序升温起始温度 80 ℃，然后以20 ℃/min 的速度升温至300 ℃，保持40 min。

2 结果与分析

2.1 底盘宿主对番茄红素途径表达的影响

以单拷贝质粒pRS41H为表达载体，使用诱导型启动子GAL1p和GAL7p控制番茄红素合成途径，分别转化S.cerevisiaeINVSc1和CEN.PK2-1C，获得酿酒酵母工程菌W1和W2，摇瓶发酵后提取产物，用HPLC进行定性和定量分析。结果显示，尽管在不同底盘宿主中导入番茄红素合成途径后，菌株的生物量差别不大，但合成番茄红素的水平有较大区别。以酿酒酵母INVSc1为底盘宿主时，番茄红素最高产量为0.025 mg/L，以酿酒酵母CEN.PK2-1C为底盘宿主时，番茄红素最高产量为0.052 mg/L，是INVSc1为底盘宿主的2倍(如图3所示)。说明酿酒酵母CEN.PK2-1C较酿酒酵母INVSc1更适合作为底盘宿主合成番茄红素，不同酿酒酵母菌株的遗传背景对目标产物合成有一定的影响，这一结果与WESTFALL等通过酿酒酵母合成青蒿二烯的研究相似[19]，可能与CEN.PK株系具有更清楚的生理特点和有较强的合成萜类化合物前体的能力有关[20]。

图3 底盘宿主对工程菌合成番茄红素的影响Fig.3 Effect of chassis hosts on lycopene production by engineered S. cerevisiae

2.2 拷贝数对番茄红素途径表达的影响

为了研究基因拷贝数对途径表达效果的影响，以酿酒酵母CEN.PK2-1C为底盘宿主，在其中转入含有番茄红素合成途径的多拷贝质粒pRS42K，构建获得酿酒酵母工程W3。分析显示，拷贝数对工程菌株的生长影响也较小，但对产物合成具有一定的影响。使用单拷贝质粒pRS41H时，番茄红素的最高产量为0.052 mg/L，而使用多拷贝质粒pRS42K时，番茄红素产量可达到0.078 mg/L，产量提高了1.5倍(如图4所示)。说明番茄红素的产量与途径表达所用载体的类型有一定关系，功能基因的拷贝数影响了外源途径的表达，由多拷贝质粒pRS42K表达番茄红素合成途径时与酵母底盘的适配性更好。

图4 拷贝数对工程菌合成番茄红素的影响Fig.4 Effect of copy number on lycopene production by engineered S. cerevisiae

2.3 启动子类型对番茄红素途径表达的影响

以多拷贝质粒pRS42K为表达载体，使用组成型启动子(TEF1p、FBA1p)调控番茄红素合成途径，转化酿酒酵母底盘CEN.PK2-1C获得了酿酒酵母工程菌W4，研究启动子对途径表达效果的影响。结果显示，当番茄红素合成基因以组成型启动子控制表达时，番茄红素产量可达到0.152 mg/L，产量提高了2倍，但对菌株生长具有一定的影响，相比初始菌株，生物量有显著下降(如图5所示)。

图5 启动子类型对工程菌合成番茄红素的影响Fig.5 Effect of promoters on lycopene production by engineered S. cerevisiae

据文献报道，较诱导型启动子，组成型启动子在酵母合成其他萜类化合物如紫衫二烯时也具有一定优势[21]，组成型启动子可能更适合酿酒酵母中途径的平衡表达。

2.4 平衡前体物供应提高番茄红素的合成

前期研究发现，导入番茄红素或其他外源合成途径后，酵母自身代谢平衡受到干扰，导致前体物供应不足[22]。为了优化番茄红素生物合成工程菌中的前体物供应，将MVA途径合成模块转化到酿酒酵母工程菌W4中，获得工程菌W5。结果显示，强化酵母工程菌MVA途径后，工程菌W5的番茄红素产量达到了3.62 mg/L，较工程菌W4提高了24倍(如图6所示)，是初始工程菌株的70倍。

图6 前体物供应对番茄红素合成的影响Fig.6 Effect of the precursor supply on lycopene production

这一产量与利用成团泛菌来源基因合成番茄红素产量为13.23 mg/L还有一定差距，可能是过表达MVA途径tHMG1、GGPS以及其他一些同工酶的编码基因有关[15]。进一步分析工程菌W4、W5的中间代谢产物累积情况，发现工程菌W5较工程菌W4均有显著提高(如图7所示)。

为了验证相关因素对番茄红素途径表达的影响在强化MVA途径后是否相同，构建了使用单拷贝质粒pRS41H为表达载体的酵母工程菌W6，工程菌W6的番茄红素产量也能达到1.32 mg/L(如图6所示)，与W1、W2、W3和W4菌株相比，合成番茄红素的产量都有不同程度的提高，而相比工程菌W5产量有所下降。说明强化MVA途径后，基因拷贝数对途径表达效果的影响相似，而通过强化MVA途径，有效地平衡了酿酒酵母合成番茄红素的前体物供给，强化了酿酒酵母类异戊二烯合成途径的代谢通量，进而增加了酿酒酵母合成番茄红素的能力。